摘要: 【原理】胚胎干细胞（Embryonic stem cells, ESCs）是从早期囊胚内细胞团中发现、能在体外培养的一种高度未分化细胞，它具有发育成各种细胞的潜能。ESCs 可用于研究细胞癌变机理和新药物的筛选。[目的]本实验旨在建立鸡ESCs分离、培养及鉴定体系，为以ESCs 的体外培养与遗传修饰为技术平台的家禽转基因研究提供技术支持。【方法】用药匙法从新鲜受精蛋中分离获取鸡ESCs，利用鸡ESCs因子培养基进行培养。获得的鸡ESCs通过形态学观察、碱性磷酸酶（Alkaline phosphatase, AKP）染色和胚胎阶段特异性表面抗原（Stage specific embryonic antigen 1, SSEA-1）染色等方式进行鉴定。【结果】无饲养层培养体系体外培养鸡ESCs能稳定传代至第6代，传代后的ESCs克隆呈AKP阳性和SSEA-1（FITC标记的羊抗鼠的二抗）阳性，说明ESCs保持未分化的状态。【结论】本实验建立了鸡ESCs 无饲养层培养体系，并成功维持未分化状态，保持其各方面生物学活性，为鸡ESCs 的基因修饰和表观遗传修饰奠定基础。
关键词: 鸡, 胚胎干细胞, 分离, 培养, 鉴定
材料与试剂
- 离心管
- 玻璃吸管
- 新鲜受精蛋（扬州翔龙禽业发展有限公司）
- Knockout DMEM (Gibco, catalog number: 10829018)
- 胎牛血清（Gibco, catalog number: 10099141）
- β-巯基乙醇（Sigma, catalog number: M3148）
- 丙酮酸钠（Gibco, catalog number: 11360-070）
- L-谷氨酰胺（sigma, catalog number: 59202C）
- 非必需氨基酸（Sigma, catalog number: M7145）
- mLIF（Millipore, catalog number: ESG1106）
- bFGF（Sigma, catalog number: F0291）
- hSCF（Sigma, catalog number: S7901）
- 鸡血清（Gbico, catalog number: 16110-082）
- 青链霉素（Solarbio, catalog number: P1400-100）
- 碱性磷酸酶染色试剂盒（索莱宝，货号：G1480）
- SSEA-1（Biolegend, San Diego, CA; dilution ratio 1:100）
- 4%多聚甲醛（Solarbio, catalog number: P1110）
- Triton X-100（索莱宝，货号：T8200）
- Tween-20（索莱宝，货号：T8220）
- 新洁尔灭
- ESCs因子培养基（见溶液配方）[1,2]
- 1% Triton（见溶液配方）
- 封闭液（见溶液配方）
- PBS-T（见溶液配方）
仪器设备
- 镊子
- 药匙
- 培养皿
- 325目钢筛
- 微量移液器
- 台式低速自动平衡离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司，TDZ4-WS）
- 荧光倒置显微镜（OLYMPUS，IX51）
- 超净工作台
实验步骤
一、ESCs的分离
- 取新鲜受精蛋，依次用新洁尔灭，75%酒精将鸡蛋表面清洗干净，置于超净工作台中。
- 利用钝端镊子对准鸡蛋的赤道面进行开口，弃去上端蛋壳。
- 左手握着下端蛋壳，右手用钝端镊子紧贴蛋壳壁旋转一圈，将蛋清去除，游离蛋黄。
- 利用药匙拨动蛋黄，找到胚盘，眼科剪刀沿着胚盘边缘卵黄膜剪成四边形或三角形，用钝端镊子夹起四边形或三角形卵黄膜（包含胚盘）的一角，小心取出放入含PBS（37 °C左右）的60 mm细胞培养皿中。
- 轻轻晃动培养皿，注意观察胚盘情况，直至圆形胚盘从卵黄膜上脱离出来。
- 利用玻璃吸管将胚盘置于PBS溶液中清洗3遍，收集胚盘至15 ml离心管。用玻璃吸管充分吹散胚盘呈单细胞悬液。
- 用325目钢筛过滤细胞悬液，高速1,000 x g离心6-8 min，收集沉淀，加入ESCs因子培养基，充分吹散重悬，计数，以5×106个细胞接种于60 mm培养皿，置于37 °C，5% CO2培养箱中培养12 h，进行细胞差速贴壁培养。
二、ESCs的培养
- 弃去培养12 h的皿中上清，用微量移液器吸取ESCs因子培养基冲刷培养皿底部来收集细胞悬液，置于15 ml离心管中，吹散。
- 台式低速自动平衡离心机高速1,000 x g离心6-8 min。
- 弃去上清，收集细胞沉淀，加ESCs因子培养基，微量移液器充分吹散重悬。
- 台式低速自动平衡离心机低速550 x g离心6-8 min后弃去上清。
- 加入ESCs因子培养基吹散重悬，以5×106个细胞重新接种于60 mm细胞培养皿，37 °C 5% CO2培养箱培养。
三、ESCs的鉴定
- 利用倒置显微镜观察鸡ESCs的生长情况和形态特征。
- 碱性磷酸酶（Alkaline phosphatase, AKP）活性鉴定：
- 取生长良好的ESCs，吸出60mm培养皿中的原培养液，缓慢加入PBS溶液，轻柔漂洗3遍。
- 缓慢加入AKP固定液固定3分钟，吸出后PBS轻柔漂洗1遍。
- 缓慢加入ALP孵育液，避光15-20分钟，吸出后PBS轻柔漂洗1遍。
- 缓慢加入核固红染色或者甲基绿染色液复染3-5分钟，吸出液体。
- PBS清洗1遍，置于倒置显微镜下观察。
- SSEA-1间接免疫荧光鉴定[3]
- 取生长良好的ESCs，吸出原培养液，缓慢加入PBS溶液，轻柔漂洗1遍。
- 缓慢加入4%多聚甲醛固定30分钟，缓慢吸出上清，用PBS进行清洗。
- 缓慢加入1% Triton-100透膜处理20分钟，缓慢吸出上清，用PBS轻柔清洗1遍。
- 缓慢加入封闭液（10% FBS的PBS）37 °C避光封闭2h。
- 缓慢吸出上清，缓慢加入SSEA-1抗体，37 °C孵育2小时或4 °C过夜
- 缓慢吸出上清，加入PBS-T清洗3次，每次5 min。
- 滴加二抗，37 °C避光孵育2h，吸出上清，PBS-T轻柔清洗3次，每次5min。
- 5 ng/μl DAPI染色10分钟后，吸出上清，加入PBS。
- 抗荧光淬灭封片剂封片，显微镜下观察。
结果与分析
- 鸡ESCs形态观察
分离后的ESCs进行在因子培养基中进行无饲养层培养并传代，ESCs的细胞形态较小，且培养后传代，逐渐形成鸟巢状（图1）。
图1. ESCs传至第三代的细胞形态图，→所示为鸟巢状ESCs克隆，标尺：60 μm
- 碱性磷酸酶（AKP）活性鉴定
通过碱性磷酸酶染色试验发现ESCs克隆能够被染色为橘黄色，表现出碱性磷酸酶活性（图2）。
图2. ESCs的AKP染色鉴定，→所示为鸟巢状ESCs克隆被染成黄色，标尺：20 μm
- SSEA-1间接免疫荧光鉴定
经间接免疫荧光鉴定分析发现ESCs能够通过标记上SSEA-1，表达绿色荧光（图3）。
图3. ESCs细胞克隆的SSEA-1的鉴定，标尺：50 μm
溶液配方
- ESCs因子培养基（郑蒙蒙等，2013）
Knockout DMEM
10% FBS
0.1 mmol/L β-巯基乙醇
1 mmol/L丙酮酸钠
2 mmol/L的L-谷氨酰胺
1%非必需氨基酸
1,000 IU/mL LIF
10 ng/mL bFGF
5 ng/mL SCF
1%的双抗
2%鸡血清 - 1% Triton
1% Triton的PBS
10 μl Triton加入990 μl PBS中。 - 封闭液
10% FBS的PBS
1 ml FBS加入9 ml的PBS - PBS-T
0.05% Tween-20的PBS
5 μl Tween-20加入995 μl PBS中
致谢
本研究得到了国家自然科学基金资助项目（31872341；31572390）、重点科研项目（2017YFE0108000）和江苏省优势学科的资助。感谢张振韬、郑蒙蒙、赵瑞丰、黄晓梅等的研究工作。
参考文献
- 赵瑞丰. 鸡CEF重编程成为PGC诱导体系的建立及其迁移归巢功能的研究.扬州:扬州大学.2018.
- 郑蒙蒙,李伟,张亚妮,等.鸡胚胎干细胞无饲养层培养体系的建立及其转染体系的优化.中国畜牧杂志, 2013(17):22-26.
- Zhang, Z., Elsayed, A. K., Shi, Q., Zhang, Y., Zuo, Q., Li, D., Lian, C., Tang, B., Xiao, T., Xu, Q., Chang, G., Chen, G., Zhang, L., Wang, K., Wang, Y., Jin, K., Wang, Y., Song, J., Cui, H. and Li, B. (2015). Crucial genes and pathways in chicken germ stem cell differentiation. J Biol Chem 290(21): 13605-13621.
Copyright: © 2022 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC.
引用格式：张晨, 赵瑞丰, 郑蒙蒙, 戴建明, 孙红艳, 左其生, 张亚妮, 李碧春. (2022). 鸡胚胎干细胞分离培养及鉴定. // 实验动物胚胎操作实验手册.
Bio-101: e1010954. DOI:
10.21769/BioProtoc.1010954.
How to cite: Zhang, C., Zhao, R. F., Zheng, M. M., Dai, J. M., Sun, H. Y., Zuo, Q. S., Zhang, Y. N. and Li, B. C. (2022). Isolation, Culture and Identification of Chicken Embryonic Stem Cells . // Embryo Manipulation Manual of Laboratory Animals.
Bio-101: e1010954. DOI:
10.21769/BioProtoc.1010954.
