猪胚胎移植
Embryo Transfer   

材料与试剂

1. TCM-199（Gibco，catalog number: 11150-059）
2. Hepes （Sigma，catalog number: H3784）
3. Penicillin（Sigma，catalog number: P3032）
4. Streptomycin（Sigma，catalog number: S1277）
5. NaCl（Sigma，catalog number: S5886）
6. BSA（Sigma，catalog number: A8022）
7. H₂O（Sigma，catalog number: W-1503） 
8. NaCl（Sigma，catalog number: S-5886）
9. KCl（Sigma，catalog number: P-4504）
10. KH₂PO₄（Sigma，catalog number: P-5655）
11. MgSO₄·7H₂O（Sigma，catalog number: M-1880）
12. NaHCO₃（Sigma，catalog number: S-8875） 
13. Na-Pyruvate（Sigma，catalog number: 4562） 
14. Ca.(Lactate)₂·5H₂O（Fisher，catalog number: C110-500）
15. L-Glutamine（Sigma，catalog number: G-7029）
16. Hypotaurine（Sigma，catalog number: H-1384）
17. NEAA（Sigma，catalog number: M7145）
18. EAA（Sigma，catalog number: B-6766）
19. Gentamicin （Gibco，catalog number: 15710-064）
20. Regumate(Intervet，catalog number: RM480150)
21. EP管（Axygen，catalog number: mct-150c）
22. 四孔板（NUNC）
23. 2.5×2.0mm玻璃管（WPI）
24. 胚胎移植管（Covidien，catalog number: 8890703021）
25. 75% 酒精（安徽安特生物化学有限公司） 
26. DPBS (Gibco，catalog number: D8537) 
27. 0.9% 生理盐水（衡阳制药有限公司）
28. 石蜡油（Sigma，catalog number: M5310）
29. 胚胎操作液 (见溶液配方)
30. 胚胎培养液PZM-3 (见溶液配方)
    

仪器设备

1. 通用型动物麻醉机（MATRX-VME） 
2. CO₂培养箱（THERMO-3111）
3. 超净工作台（瑞智净化）
4. 体式显微镜（NIKON-SMZ645）
5. 显微镜加热台（THERMO）
6. 恒温胚胎运输箱（FHK，NFA451）
7. 移液枪（EPPENDORF）
   

实验步骤

1. 自然发情受体猪
   对一定数量的基础母猪每天两次进行发情检测，选择核移植当天或晚一天的健康母猪作为胚胎移植受体。
2. 受体猪同期发情
   根据受体猪发情情况及移植计划，对一定数量的受体猪每天的饲料中掺入18-22mg/头 Regumate；停止饲喂 Regumate 105小时后肌肉注射1000单位/头HCG；HCG注射后22-26小时进行胚胎移植。
   注意：以上受体准备适用于移植1-2细胞期的早期胚胎，如果是移植桑椹胚或囊胚，应依照胚胎与受体发情状态同步的原则，或者受体发情时间略晚于胚胎激活时间。
3. 胚胎移植
   猪是多胎动物，研究表明，猪的妊娠启动和维持需要在胚胎发育第12天即胚胎植入时，至少有4枚正常发育的胚胎提供妊娠信号。考虑到体外培养对胚胎发育的负面影响，应尽量缩短体外培养时间，因此，多数研究采用早期胚胎进行移植。如果移植的是核移植胚胎，考虑到植入胚胎质量不高，需要增加移植胚胎的数量以保证有足够的胚胎启动和维持妊娠。目前，较为普遍的做法是核移植后培养18-22小时，选择形态良好的胚胎通过手术的方法移入受体输卵管中，每只受体移植100枚以上的重构胚胎。如果移植的胚胎是体内冲取的受精卵每只受体移植20-30个受精卵。
   将培养中的胚胎从胚胎培养液转移入盛有操作液的1.5 mL EP管中，放入恒温胚胎运输箱中带至猪场手术室。对受体猪注射氯胺酮进行诱导麻醉，带上麻醉面罩，打开麻醉机，用1.5%-3%的异氟烷维持麻醉。采用常规外科手术方法在腹中线倒数第二对乳头处切口7—10 cm，牵引出一侧子宫角，并沿子宫角、输卵管取出该侧卵巢，以37℃生理盐水冲洗子宫与卵巢，以保持生殖道温度与湿度，并观察排卵情况。体视显微镜下，用1ml注射器将胚胎吸入胚胎移植管中。先吸取一段操作液，隔一段气体再吸取胚胎至移植管中，后再隔一段气体，吸入一段操作液。将装有胚胎的移植管插入输卵管，尽量送入输卵管深部，慢慢推出胚胎，再用手指向子宫端轻轻挤压已输入胚胎，然后，慢慢撤出移植管（图2）。将输卵管、子宫复位，在切口敷以青链霉素，按腹膜、皮下筋膜、皮肤三层缝合。手术后肌肉注射青链霉素防止创口感染发炎，并且在接下来连续几天都要进行术后护理。
   移植完毕后，用37℃灭菌生理盐水湿润子宫，冲去凝血块，再涂少许灭菌液体石蜡，将器官复位。按顺序将腹膜，皮下筋膜，皮肤层三层分别缝合后，涂抹磺胺等消炎防腐药，在伤口周围涂碘酒，肌注青毒素和链霉素。
   胚胎移植完成后24-26天进行B超监测妊娠情况，并对怀孕受体每隔一周进行一次B超监测，追踪克隆胚胎发育情况。
   

结果与分析

胚胎移植后24-26天进行B超监测妊娠情况，受精卵移植后妊娠率80%左右，核移植胚胎供体细胞不同，妊娠率不同在30-80%之间。

失败经验

受体的同情发情时胚胎移植成功的关键，与正常受精胚胎相比核移植胚胎发育滞后，妊娠率也不同，一般在30%~80%之间。可选择核移植第二天发情受体进行胚胎移植。

溶液配方

1. 胚胎操作液
   9.500 g TCM-199（Gibco，11150-059）
   0.050 g NaHCO3 (Sigma，S4019)
   0.750 g Hepes (Sigma，H3784)
   0.050 g Penicillin（Sigma，P3032）
   0.060 g Streptomycin（Sigma，S1277）
   1.755 g NaCl（Sigma，S5886）
   3.00 g BSA
   1000 mL Milli Q H₂O，溶解后调节PH为7.2-7.4溶解后调节PH为7.2-7.4，渗透压为295-310 mOsm。 
2. 胚胎培养液PZM-3
   108.00 mM NaCl（Sigma，S-5886）
   10 mM KCl（Sigma，P-4504）
   0.35 mM KH₂PO₄（Sigma，P-5655）
   0.40 mM MgSO₄·7H₂O（Sigma，M-1880）
   25.07 mM NaHCO₃（Sigma，S-8875）
   0.2 mM Na-Pyruvate（Sigma，4562）
   2.0 mM Ca.(Lactate)₂·5H₂O（Fisher，C110-500）
   1.0 mM L-Glutamine（Sigma，G-7029）
   5.0 mM Hypotaurine（Sigma，H-1384）
   10 ml/L NEAA（Sigma，M7145）
   20 mg/mL EAA（Sigma，B-6766）
   0.05 mg/mL Gentamicin （Gibco，15710-064）
   3 mg/ml BSA（Sigma，A8022）
   

致谢

1. 感谢国家重点研发计划“干细胞与转化研究”专项提供经费支持。
2. 已发表的使用本实验方案的文章“A Huntingtin Knockin Pig Model Recapitulates Features of Selective Neurodegeneration in Huntington's Disease”“Piglets cloned from induced pluripotent stem cells”。 
3. 该实验方案摘自“Production of Cloned Pigs by Using Somatic Cells as Donors”
   

参考文献

1. Lai, L., Kolber-Simonds, D., Park, K. W., Cheong, H. T., Greenstein, J. L., Im, G. S., Samuel, M., Bonk, A., Rieke, A., Day, B. N., Murphy, C. N., Carter, D. B., Hawley, R. J. and Prather, R. S. (2002). Production of alpha-1,3-galactosyltransferase knockout pigs by nuclear transfer cloning.Science 295(5557): 1089-1092.
2. Lai, L. and Prather, R. S. (2003). Production of cloned pigs by using somatic cells as donors. Cloning Stem Cells 5(4): 233-241.
3. Lai, L., Kang, J. X., Li, R., Wang, J., Witt, W. T., Yong, H. Y., Hao, Y., Wax, D. M., Murphy, C. N., Rieke, A., Samuel, M., Linville, M. L., Korte, S. W., Evans, R. W., Starzl, T. E., Prather, R. S. and Dai, Y. (2006). Generation of cloned transgenic pigs rich in omega-3 fatty acids. Nat Biotechnol 24(4): 435-436.
4. 樊娜娜，杨东山，赖良学.(2009). 克隆猪技术及其在转基因猪研究中的应用. 生命科学, 21:652-657.
5. Yang, D., Wang, C. E., Zhao, B., Li, W., Ouyang, Z., Liu, Z., Yang, H., Fan, P., O'Neill, A., Gu, W., Yi, H., Li, S., Lai, L. and Li, X. J. (2010). Expression of Huntington's disease protein results in apoptotic neurons in the brains of cloned transgenic pigs. Hum Mol Genet 19(20): 3983-3994.