摘要: 猪等大动物采用体内冲取法获得受精卵代价昂贵,即使经超数排卵,一头母猪仅能获得20-30枚受精卵。而体外成熟卵母细胞可以大量获得,采用体外受精的方式,可以获得大量的受精卵
关键词: 猪卵母细胞, 精子, 体外受精
材料与试剂
- 四孔板(NUNC)
- 培养皿(NUNC)
- 2.5×2.0mm玻璃管(WPI)
- BSA(Sigma,catalog number: A8022)
- NaHCO3(Sigma,catalog number: S-8875)
- Na-Pyruvate(Sigma,catalog number: 4562)
- HEPES (Na-Salt)(Sigma,catalog number: H3784)
- HEPES (Acid) (Sigma,catalog number: H4034)
- L-Glutamine(Sigma,catalog number: G-7029)
- TCM 199 [10x] (Sigma,catalog number: M0650)
- H2O(Sigma,catalog number: W1503).
- NaCl(Sigma,catalog number: S-5886)
- KCl(Sigma,catalog number: P-4504)
- NaH2PO4(Sigma,catalog number: S-5011)
- MgSO4(Sigma,catalog number: M-2343)
- CaCl2·2H2O(Sigma,catalog number: C-7902)
- Na Lactate(Sigma,catalog number: L7900)
- Caffein (Sigma,catalog number: C-0750)
- KH2PO4(Sigma,catalog number: P-5655)
- MgSO4·7H2O(Sigma,catalog number: M-1880)
- Ca.(Lactate)2·5H2O(Fisher,catalog number: C110-500)
- Hypotaurine(Sigma,catalog number: H-1384)
- NEAA(Sigma,catalog number: M7145)
- EAA(Sigma,catalog number: B-6766)
- Gentamicin(Gibco,catalog number: 15710-064)
- 75% 酒精(安徽安特生物化学有限公司)
- DPBS (Gibco D8537)
- 0.9% 生理盐水(衡阳制药有限公司)
- 石蜡油(Sigma,catalog number: M5310)
仪器设备
- 培养箱(THERMO-3111)
- 超净工作台(瑞智净化)
- 体式显微镜(NIKON-SMZ645)
- 显微镜加热台(THERMO)
- 移液枪(EPPENDORF)
实验步骤
- 轻轻混合新鲜精子。
- 用70%乙醇消毒装精子的袋子和剪刀,用纸巾擦干后,在袋子一端剪开一个小口。
- 将精子移入离心管中。
- 1100 rpm(300 G)离心10分钟。
- 去除上清液并添加2ml猪精子洗涤液。
- 用移液器轻轻重悬精子。
- 1100 rpm(300 G)离心10分钟。
- 重复5-7次。
- 去除上清,并添加2 ml 猪HEPES洗涤液,重悬精子。
- 1100 rpm(300 G)离心10分钟。
- 去除上清,并添加猪HEPES洗涤液至500 µl。
- 用血细胞计数板对精子进行精确计数。
- 调整精子密度为40000精子/300 µl.
- 将装有精子的离心管45度角放置于培养箱中2小时。
- 体内或者体外成熟的猪卵母细胞,用透明质酸酶消化去掉周围的卵丘细胞。
- 将去卵丘的卵母细胞转移到猪受精液中洗涤3次。
- 将洗涤好的卵母细胞和稀释好的15µl精子转移到平衡好的受精液中,轻轻混合,每孔卵母细胞不超过80枚。
- 将精子和卵母细胞在培养箱中共孵育4-6小时。
- 将受精的卵母细胞在胚胎培养液中洗涤三遍后转移入胚胎培养液PZM-3,于培养箱中(5%CO2、饱和湿度、38.5℃)继续培养。
- 受精卵培养48小时后观察卵裂率,7天检查囊胚率。
结果与分析
受精卵培养48小时卵裂率为80%左右,7天囊胚率为20%左右
失败经验
体外受精容易形成多精受精,需要控制精卵比例。
溶液配方
- 猪精子洗涤液
1 mg/ml BSA
0.9% NaCl - 猪HEPES洗涤液
0.084 g NaHCO3
0.11 g Na-Pyruvate
2.0824 g HEPES (Na-Salt)
1.0724 g HEPES (Acid)
0.073 gh L-Glutamine
50 ml Medium 199 [10x]
450 ml H2O - 猪受精液
2.63 g NaCl
448 mg KCl
30 mg NaH2PO4
1.05 g NaHCO3
301 mg MgSO4
1.192 g HEPES-acid
0.011 g Na-Pyruvat
0.05 g CaCl2, 2H2O
570 µl Na Lactate
25 mg Gentamicin
0.0121 g Caffein
1.5 g BSA
494.3 ml H2O - 胚胎培养液PZM-3
108.00 mM NaCl
10 mM KCl
0.35 mM KH2PO4
0.40 mM MgSO4·7H2O
25.07 mM NaHCO3
0.2 mM Na-Pyruvate
2.0 mM Ca.(Lactate)2·5H2O
1.0 mM L-Glutamine
5.0 mM Hypotaurine
10 ml/L NEAA
20 mg/mL EAA
0.05 mg/mL Gentamicin
3 mg/ml BSA
致谢
- 感谢国家重点研发计划“干细胞与转化研究”专项提供经费支持。
参考文献
- 吕明. (2013). 甲基-β-环化糊精对猪体外受精的影响研究.东北农业大学硕士毕业论文
- 卢晟盛.(2014). 影响猪体外受精因素的研究. 广西大学博士毕业论文
Copyright: © 2022 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC.
引用格式:樊娜娜, 欧阳振, 李昊, 赖良学. (2022). 猪体外受精. // 实验动物胚胎操作实验手册.
Bio-101: e1010967. DOI:
10.21769/BioProtoc.1010967.
How to cite: Pan, N. N., Ouyang, Z, Li, H. and Lan, L. X. (2022). Pig In Vitro Fertilization. // Embryo Manipulation Manual of Laboratory Animals.
Bio-101: e1010967. DOI:
10.21769/BioProtoc.1010967.