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猪体外受精
Pig In Vitro Fertilization   

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摘要: 猪等大动物采用体内冲取法获得受精卵代价昂贵,即使经超数排卵,一头母猪仅能获得20-30枚受精卵。而体外成熟卵母细胞可以大量获得,采用体外受精的方式,可以获得大量的受精卵

关键词: 猪卵母细胞, 精子, 体外受精

材料与试剂

  1. 四孔板(NUNC)
  2. 培养皿(NUNC)
  3. 2.5×2.0mm玻璃管(WPI)
  4. BSA(Sigma,catalog number: A8022)
  5. NaHCO3(Sigma,catalog number: S-8875)
  6. Na-Pyruvate(Sigma,catalog number: 4562)
  7. HEPES (Na-Salt)(Sigma,catalog number: H3784)
  8. HEPES (Acid) (Sigma,catalog number: H4034)
  9. L-Glutamine(Sigma,catalog number: G-7029)
  10. TCM 199 [10x] (Sigma,catalog number: M0650)
  11. H2O(Sigma,catalog number: W1503).
  12. NaCl(Sigma,catalog number: S-5886)
  13. KCl(Sigma,catalog number: P-4504)
  14. NaH2PO4(Sigma,catalog number: S-5011)
  15. MgSO4(Sigma,catalog number: M-2343)
  16. CaCl2·2H2O(Sigma,catalog number: C-7902)
  17. Na Lactate(Sigma,catalog number: L7900)
  18. Caffein (Sigma,catalog number: C-0750)
  19. KH2PO4(Sigma,catalog number: P-5655)
  20. MgSO4·7H2O(Sigma,catalog number: M-1880)
  21. Ca.(Lactate)2·5H2O(Fisher,catalog number: C110-500)
  22. Hypotaurine(Sigma,catalog number: H-1384)
  23. NEAA(Sigma,catalog number: M7145)
  24. EAA(Sigma,catalog number: B-6766)
  25. Gentamicin(Gibco,catalog number: 15710-064)
  26. 75% 酒精(安徽安特生物化学有限公司) 
  27. DPBS (Gibco D8537) 
  28. 0.9% 生理盐水(衡阳制药有限公司)
  29. 石蜡油(Sigma,catalog number: M5310)

仪器设备

  1. 培养箱(THERMO-3111)
  2. 超净工作台(瑞智净化)
  3. 体式显微镜(NIKON-SMZ645)
  4. 显微镜加热台(THERMO)
  5. 移液枪(EPPENDORF)

实验步骤

  1. 轻轻混合新鲜精子。
  2. 用70%乙醇消毒装精子的袋子和剪刀,用纸巾擦干后,在袋子一端剪开一个小口。
  3. 将精子移入离心管中。
  4. 1100 rpm(300 G)离心10分钟。
  5. 去除上清液并添加2ml猪精子洗涤液。
  6. 用移液器轻轻重悬精子。
  7. 1100 rpm(300 G)离心10分钟。
  8. 重复5-7次。
  9. 去除上清,并添加2 ml 猪HEPES洗涤液,重悬精子。
  10. 1100 rpm(300 G)离心10分钟。
  11. 去除上清,并添加猪HEPES洗涤液至500 µl。
  12. 用血细胞计数板对精子进行精确计数。
  13. 调整精子密度为40000精子/300 µl.
  14. 将装有精子的离心管45度角放置于培养箱中2小时。
  15. 体内或者体外成熟的猪卵母细胞,用透明质酸酶消化去掉周围的卵丘细胞。
  16. 将去卵丘的卵母细胞转移到猪受精液中洗涤3次。
  17. 将洗涤好的卵母细胞和稀释好的15µl精子转移到平衡好的受精液中,轻轻混合,每孔卵母细胞不超过80枚。
  18. 将精子和卵母细胞在培养箱中共孵育4-6小时。
  19. 将受精的卵母细胞在胚胎培养液中洗涤三遍后转移入胚胎培养液PZM-3,于培养箱中(5%CO2、饱和湿度、38.5℃)继续培养。
  20. 受精卵培养48小时后观察卵裂率,7天检查囊胚率。

结果与分析

受精卵培养48小时卵裂率为80%左右,7天囊胚率为20%左右

失败经验

体外受精容易形成多精受精,需要控制精卵比例。

溶液配方

  1. 猪精子洗涤液
    1 mg/ml BSA
    0.9% NaCl
  2. 猪HEPES洗涤液
    0.084 g NaHCO3
    0.11 g Na-Pyruvate
    2.0824 g HEPES (Na-Salt)
    1.0724 g HEPES (Acid)
    0.073 gh L-Glutamine
    50 ml Medium 199 [10x]
    450 ml H2O
  3. 猪受精液
    2.63 g NaCl
    448 mg KCl
    30 mg NaH2PO4
    1.05 g NaHCO3
    301 mg MgSO4
    1.192 g HEPES-acid
    0.011 g Na-Pyruvat
    0.05 g CaCl2, 2H2O
    570 µl Na Lactate
    25 mg Gentamicin
    0.0121 g Caffein
    1.5 g BSA
    494.3 ml H2
  4. 胚胎培养液PZM-3
    108.00 mM NaCl
    10 mM KCl
    0.35 mM KH2PO4
    0.40 mM MgSO4·7H2O
    25.07 mM NaHCO3
    0.2 mM Na-Pyruvate
    2.0 mM Ca.(Lactate)2·5H2O
    1.0 mM L-Glutamine
    5.0 mM Hypotaurine
    10 ml/L NEAA
    20 mg/mL EAA
    0.05 mg/mL Gentamicin
    3 mg/ml BSA

致谢

  1. 感谢国家重点研发计划“干细胞与转化研究”专项提供经费支持。

参考文献

  1. 吕明. (2013). 甲基-β-环化糊精对猪体外受精的影响研究.东北农业大学硕士毕业论文
  2. 卢晟盛.(2014). 影响猪体外受精因素的研究. 广西大学博士毕业论文
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Copyright: © 2022 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC.
引用格式:樊娜娜, 欧阳振, 李昊, 赖良学. (2022). 猪体外受精. // 实验动物胚胎操作实验手册. Bio-101: e1010967. DOI: 10.21769/BioProtoc.1010967.
How to cite: Pan, N. N., Ouyang, Z, Li, H. and Lan, L. X. (2022). Pig In Vitro Fertilization. // Embryo Manipulation Manual of Laboratory Animals. Bio-101: e1010967. DOI: 10.21769/BioProtoc.1010967.
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