犬胎儿成纤维细胞基因编辑
Gene Editing of Canine Fetal Fibroblasts   

研究背景

利用胎儿成纤维细胞、卵丘细胞或成体成纤维细胞进行体细胞克隆，已成功地培育了各种克隆哺乳动物。关于哪种供体细胞最适合SCNT有很多讨论，但一般认为未分化的供体细胞（即胚胎卵裂球）更适合用于SCNT。此外，由于胎儿成纤维细胞具有高增殖率，因此被广泛用于生产转基因克隆动物。因此，胎儿成纤维细胞被认为是在几个物种中产生克隆后代的最合适的供体细胞。然而，犬和猫的第一个克隆后代分别来自成体皮肤成纤维细胞和卵丘细胞。

材料与试剂

1. DMEM（Hyclone）
2. FBS（Gibco）
3. 丙酮酸钠（Gibco）
4. 谷氨酰胺（Gibco）
5. NEAA（Gibco）
6. 质粒（Addgene）
7. G418（Merk）
8. 电转液（Neon Transfection System 100μL Kit）
9. 胰酶（Gibco）
10. 克隆环（国产）
11. 培养板（Corning）
    

仪器设备

1. 电转仪（Invitrogen Neon）
2. 培养箱（Thermo-4111）
3. 生物安全柜（ESCO-AC2-6S1）
4. 倒置显微镜（Olympus-IX73）
   

实验步骤

1. 复苏犬胎儿成纤维细胞（30天胎儿）于10 cm培养皿中；
2. 待细胞长到约90%汇合时，消化细胞；
3. 将细胞用PBS清洗两遍；
4. 用含有Cas9和sgRNA质粒的PBS（100 μl）重悬细胞，1x10⁵细胞电转0.5μg质粒(CMV-CAS9:U6-sgRNA = 1:1)；
5. 吸入电转枪中，并插入到电转液中准备电转；
6. 电转（电转参数：电压1350 V；时间 30 ms；脉冲次数 1次）；
7. 电转后将细胞再养到10 cm培养皿中；
8. 电转后48 h再消化细胞，准备分盘；
9. 细胞分盘，将细胞进行稀释，再种入10 cm培养皿中，40X显微镜视野中可见5-7个细胞即可；
10. 在分盘后24 h更换成含G418（300 μg/ml）的培养基，每三天换一次液；
11. 第8至10天根据细胞克隆大小选择挑取克隆时间；
12. 用克隆环进行挑克隆，挑出的细胞培养到24孔板中；
13. 细胞长满后传至12孔板中，留取约1/4的细胞进行鉴定；
14. 鉴定后的阳性克隆细胞在12孔板中长满后进行冷冻，保存于液氮中。
    

结果与分析

1. 不同克隆基因型不一样；
2. 挑克隆时如果两个克隆相距很近则舍弃，避免不同克隆细胞间的相互污染。
   

失败经验

1. 细胞分盘时密度过大，导致最后形成的克隆间距太小，无法挑取克隆。

溶液配方

1. 细胞培养液
   DMEM+15%FBS+1% 丙酮酸钠+1%谷氨酰胺+1NEAA
   

致谢

1. 感谢十二五国家科技重大专项“实验用Beagle犬及疾病模式犬研究开发平台”[2011ZX09307-304]提供的经费支持；
2. 感谢广州生物医药研究总院有限公司提供的实验场地、实验用犬及相关技术支持；
3. 感谢北京希诺谷生物科技有限公司共同参与的技术研究；
4. 研究成果以“Generation of gene-target dogs using CRISPR/Cas9 system；Generation of ApoE deficient dogs via combination of embryo injection of CRISPR/Cas9 with somatic cell nuclear transfer”分别发表在Journal of Molecular Cell Biology和Journal of Genetics and Genomics杂志上。
   

参考文献

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