犬体细胞克隆
Canine Somatic Cell Nuclear Transfer   

材料与试剂

1. 胚胎操作液（自配）
2. 细胞融合液（自配）
3. M199（Invitrogen）
4. FBS（Gibco）
5. 透明质酸酶（Sigma）
6. Ionomycin（Sigma）
7. 6-DMAP（Sigma）
8. 矿物油（Sigma）
9. 培养皿（Corning）
10. 口吸管（自制）
11. 玻璃针（国产）
    

仪器设备

1. 倒置显微镜（Olympus-IX73）
2. 显微操作系统（TransferMan 4r）
3. CO₂培养箱（Thermo-4111）
4. 生物安全柜（ESCO-AC2-6S1）
5. 体视显微镜（Nikon-SMZ745）
6. 电融合仪（BTX-ECM2001）
   

实验步骤

1. 确定犬卵母细胞成熟的时间并冲卵，收集体内成熟的卵母细胞；
2. 用0.1%的透明质酸酶脱去卵母细胞上的颗粒细胞；
3. 将脱去颗粒细胞的卵母细胞用Hoechst染色5 min；
4. 染色完成后清洗胚胎，并将胚胎转移到胚胎操作液中；
5. 在倒置显微镜下用固定针固定好卵母细胞，将极体置于3点钟方向；
6. 在荧光照射下可以看到细胞核，并用注射针吸去细胞核，第一极体及周边的胞质；
7. 用注射针吸取体细胞，并将体细胞注射到去核的卵母细胞卵周隙中；
8. 将重构好的胚胎用电融合液清洗两次，再移入电融合液中；
9. 调节好电融合参数（电压：4 kV/cm；时间：10 μs；脉冲数：2次），进行电融合；
10. 融合后的胚胎用胚胎培养液清洗3遍，转入胚胎培养基中，放入培养箱30 min；
11. 电融合后的胚胎再进行化学激活（10 μmol/L Ionomycin处理4 min；1.9 mmol/L 6-DMAP处理4 h）；
12. 激活后用胚胎培养基清洗3遍，放入培养箱中培养，待移植。
    

结果与分析

1. 重构胚胎的融合率低，可能与卵母细胞的成熟程度或是融合的条件和参数有关；
2. 体细胞克隆效率低，可能与体细胞的类型和整个克隆操作效率有关。
   

失败经验

1. 细胞融合过程中需要将胚胎摆好，让体细胞的位置与电流方向垂直；
2. 细胞电融合过程中可以适当提高电压或是换用点状电极。
   

溶液配方

1. 胚胎操作液
   M199+10%FBS
2. 胚胎培养液（SOF）
   3%(v/v) EAA + 1%(v/v) NEAA + BSA (3 g/L) + Hepes (10 mM) + NaCl (63.35 mg/ml) + KCl (5.35 mg/ml) + KH₂PO₄ (1.6 mg/ml) + MgCl·6H₂O (1.8 mg/ml) + NaHCO₃ (21 mg/ml) + CaCl·2H₂O (26.2 mg/ml) + L-Glu (29.2 mg/ml) + 1% P/S(v/v) + 肌醇 (0.5 mg/ml) + 丙酮酸钠 (0.2 mM) + 0.6%乳酸钠(v/v)
3. 电融合液
   0.26 M mannitol + 0.1 mM MgSO4 + 0.5 mM Hepes + 0.05%(w/v) BSA
   

致谢

1. 感谢北京希诺谷生物科技有限公司提供的实验场地、实验用犬及技术研发；
2. 研究成果以“Generation of ApoE deficient dogs via combination of embryo injection of CRISPR/Cas9 with somatic cell nuclear transfer”发表在Journal of Genetics and Genomics杂志上。
   

参考文献

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