摘要: 体细胞克隆是指将体细胞注射到去核卵母细胞中,并进行融合构建重构胚胎,再将其移植回受体输卵管,使之发育成一个完整个体的一项技术。通过该技术获得的后代其绝大部分遗传物质完全来自于体细胞。因此,该技术可以快速获得大量优良性状的个体或是进行保种。通过探讨犬的体细胞克隆技术,可以成功实现犬优良性状个体的快速扩繁,同时也可以对体细胞进行基因编辑,再进行克隆,进而改变犬的某些性状。
关键词: 体细胞克隆, 体细胞, 遗传物质, 细胞融合
材料与试剂
- 胚胎操作液(自配)
- 细胞融合液(自配)
- M199(Invitrogen)
- FBS(Gibco)
- 透明质酸酶(Sigma)
- Ionomycin(Sigma)
- 6-DMAP(Sigma)
- 矿物油(Sigma)
- 培养皿(Corning)
- 口吸管(自制)
- 玻璃针(国产)
仪器设备
- 倒置显微镜(Olympus-IX73)
- 显微操作系统(TransferMan 4r)
- CO2培养箱(Thermo-4111)
- 生物安全柜(ESCO-AC2-6S1)
- 体视显微镜(Nikon-SMZ745)
- 电融合仪(BTX-ECM2001)
实验步骤
- 确定犬卵母细胞成熟的时间并冲卵,收集体内成熟的卵母细胞;
- 用0.1%的透明质酸酶脱去卵母细胞上的颗粒细胞;
- 将脱去颗粒细胞的卵母细胞用Hoechst染色5 min;
- 染色完成后清洗胚胎,并将胚胎转移到胚胎操作液中;
- 在倒置显微镜下用固定针固定好卵母细胞,将极体置于3点钟方向;
- 在荧光照射下可以看到细胞核,并用注射针吸去细胞核,第一极体及周边的胞质;
- 用注射针吸取体细胞,并将体细胞注射到去核的卵母细胞卵周隙中;
- 将重构好的胚胎用电融合液清洗两次,再移入电融合液中;
- 调节好电融合参数(电压:4 kV/cm;时间:10 μs;脉冲数:2次),进行电融合;
- 融合后的胚胎用胚胎培养液清洗3遍,转入胚胎培养基中,放入培养箱30 min;
- 电融合后的胚胎再进行化学激活(10 μmol/L Ionomycin处理4 min;1.9 mmol/L 6-DMAP处理4 h);
- 激活后用胚胎培养基清洗3遍,放入培养箱中培养,待移植。
结果与分析
- 重构胚胎的融合率低,可能与卵母细胞的成熟程度或是融合的条件和参数有关;
- 体细胞克隆效率低,可能与体细胞的类型和整个克隆操作效率有关。
失败经验
- 细胞融合过程中需要将胚胎摆好,让体细胞的位置与电流方向垂直;
- 细胞电融合过程中可以适当提高电压或是换用点状电极。
溶液配方
- 胚胎操作液
M199+10%FBS - 胚胎培养液(SOF)
3%(v/v) EAA + 1%(v/v) NEAA + BSA (3 g/L) + Hepes (10 mM) + NaCl (63.35 mg/ml) + KCl (5.35 mg/ml) + KH2PO4 (1.6 mg/ml) + MgCl·6H2O (1.8 mg/ml) + NaHCO3 (21 mg/ml) + CaCl·2H2O (26.2 mg/ml) + L-Glu (29.2 mg/ml) + 1% P/S(v/v) + 肌醇 (0.5 mg/ml) + 丙酮酸钠 (0.2 mM) + 0.6%乳酸钠(v/v) - 电融合液
0.26 M mannitol + 0.1 mM MgSO4 + 0.5 mM Hepes + 0.05%(w/v) BSA
致谢
- 感谢北京希诺谷生物科技有限公司提供的实验场地、实验用犬及技术研发;
- 研究成果以“Generation of ApoE deficient dogs via combination of embryo injection of CRISPR/Cas9 with somatic cell nuclear transfer”发表在Journal of Genetics and Genomics杂志上。
参考文献
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Copyright: © 2022 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC.
引用格式:王晓民, 赖良学. (2022). 犬体细胞克隆. // 实验动物胚胎操作实验手册.
Bio-101: e1010974. DOI:
10.21769/BioProtoc.1010974.
How to cite: Wang, X. M. and Lan, L. X. (2022). Canine Somatic Cell Nuclear Transfer. // Embryo Manipulation Manual of Laboratory Animals.
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