食蟹猴超数排卵与卵母细胞采集流程
Superovulation and Oocyte Collection   

材料与试剂

试剂

1. NaCl（Sigma-Aldrich，catalog number：S7653）
2. KCl（Sigma-Aldrich，catalog number：P5405）
3. CaCl₂·2H₂O（Sigma-Aldrich，catalog number：C7902）
4. MgCl₂·6H₂O（Sigma-Aldrich，catalog number：M2670
5. NaH₂PO₄（Sigma-Aldrich，catalog number：S8282）
6. NaHCO₃（Sigma-Aldrich，catalog number：S5761）
7. HEPES（Sigma-Aldrich，catalog number：H3375）
8. D-Glucose（Sigma-Aldrich，catalog number：G7528）
9. Sodium Pyruvate（Sigma-Aldrich，catalog number：P5280）
10. Sodium lactate (60% syrup)（Sigma-Aldrich，catalog number：L4263）
11. BSA（absin，catalog number：abs9156）
12. Penicillin-streptomycin (100X)（gibco，catalog number：15070-063）
13. Calcium lactate pentahydrate（Sigma-Aldrich，catalog number：C8356）
14. Glutamine（Sigma-Aldrich，catalog number：G8540）
15. Phenol Red（Sigma-Aldrich，catalog number：P0290）
16. Estradiol（Sigma-Aldrich，catalog number：E2758）
17. FBS（gibco）
18. CMRL Medium 1066（gibco，catalog number：11530-037）
19. Progesterone（Sigma-Aldrich，catalog number：P6149）
    
    

1. 1 ml带针头注射器（一次性）
2. 氯化钠注射液/100 ml:0.9 g上海长征富民金山制药有限公司
3. 重组人促卵泡激素注射液（果纳芬）450 IU/0.75 ml英国Merck Serono Europe Ltd.
4. 重组人绒促性素注射液（艾泽）250 μg/0.5 ml 英国Merck Serono Europe Ltd.
   
   
   

二、腹腔镜系统取卵法

1. 15 ml 离心管（Corning，catalog number：430791）
2. 18-G 卵泡吸取针（Olympus，catalog number：G19715）
3. 移液枪 (Eppendorf)
4. 40 μm 过滤器（FALCON，catalog number：352340）
5. 口吸管（北京正天，catalog number：BJ-40）
6. 不可吸收缝合线（2-0）
7. 可吸收性外科缝线（3-0）
8. 手术器械包（抓钳、气腹针、戳卡、眼科剪、镊子、持针钳、止血钳、圆针、三棱针。以上物品高压灭菌备用。）
9. 3.5 cm培养皿（Coring，catalog number：430165）
10. 6 cm培养皿（Coring，catalog number：430166）
11. 10 cm培养皿（Coring，catalog number：430167）
12. 75%酒精
13. 碘酒
14. 舒泰 50 维克贸易（上海）有限公司3597133073812
15. 硫酸阿托品注射液（上海禾丰制药有限公司）
16. 注射用青霉素钠/80万单位 华北制药股份有限公司
17. 布洛芬
18. 矿物油（Sigma，catalog number：M8410）
19. 肝素钠（上海三杰，catalog number：091201）
20. Hyaluronidase（Sigma，catalog number：H3884）
21. 高纯氮
22. Tyrode's Albumin Lactate Pyruvate medium with HEPES (TH3) （见溶液配方表1）
23. CMRL-1066（见溶液配方表2）

仪器设备

一、超数排卵

1. 4°冰箱
2. B超仪ACUSON NX3 Elite西门子

二、腹腔镜系统取卵法

1. 气腹机（OLYMPUS UHI-3）
2. 高辉度光源装置（OLYMPUS CLH-250）
3. 振荡器（Kylin-Bell Lab Instruments, catalog number：QH-600）
4. 负压吸引泵（Cook K-MAR-5200）
5. 管式加热器（Cook）
6. 体视显微镜（Olympus，model：SZX7）
7. 培养箱（Thermo Scientific，model：Forma 3111、Forma 371）
8. 摄像系统（OLYMPUS OTV-SC2）
9. 显示屏（SONY）

实验步骤

一、超数排卵流程

1. 制定详细的超排计划，取得所在单位动物实验管理委员会批准，组织安排好相关人员。
2. 制定超排方案：从月经周期的第3天晚上开始，见血当天算第1天(1~3天均可)，每天注射2次18.75 IU果纳芬，2次激素注射间隔时间在10~12小时，注射8天，第11天晚上注射1000 IU hCG。hCG处理33-37 h时，使用腹腔镜观察整个腹腔和卵巢超排情况，利用负压吸引系统从卵巢中吸取直径大于3 mm的卵泡，获得卵母细胞。
3. 挑选实验猴，根据动物档案挑选年龄在3-8岁、体重3-5 kg、距上一次取卵时间间隔大于三个月的猴做卵供体，并且该猴必须健康状况良好。
4. 激素保存及配制，配制好的激素液体放置4 °C环境存放3天，否则冻存在-20 °C冰箱中，避免反复冻融，不要轻易替换激素的批号和厂商，否则应从新检测超排的效果。
5. 激素注射过程中，注意核对猴号及激素剂量，每次肌肉注射量要达到0.5 ml，如有漏液要及时补给。
6. B超辅助建议在超排的第6~8天进行，卵泡直径大于3 mm数量大于4个时，可继续超排和hCG处理，否则停止超排，节省时间和药品。

二、腹腔镜系统取卵法（图1-图5）

1. 实验猴准备
   1. 实验动物手术前禁食禁水12 h，以免手术时因麻醉造成动物呕吐窒息或取卵困难。
   2. 麻醉：舒泰50，剂量4-6 mg/kg，肌肉注射。
   3. 麻醉后给药：阿托品0.1 mg/kg，皮下注射；青霉素10万单位/kg，肌肉注射。
   4. 被毛：上至肚脐上方3 cm处，下至腹股沟处，将整个肚皮的毛剔除干净。
   5. 保定：麻醉后的实验猴以头低臀高的姿势放置手术台上，然后将四肢分别用绷带固定在手术台的四个支架上。
   6. 消毒：先用1.8-2.2%碘酊对术部进行消毒（腹部剃毛区全部消毒），待碘酊干燥后，用75%的酒精脱碘三次。
   7. 在无菌条件下，铺上一次性无菌洞巾，暴露术区。
2. 手术方法
   1. 气腹针以45度角于脐轮上缘1 cm处插入腹腔，接气腹机，进气速度不超过1 L/min,腹腔内压力不超过24 mmHg。
   2. 待腹部鼓起皮肤无褶皱后，拔掉气腹针，用眼科剪沿气腹针针眼向肚脐方向剪 0.5cm 的切口，提起脐上皮肤，将戳卡先斜后垂直慢慢插入腹腔，拔出套管芯， 接通光源及显示屏，缓慢插入腹腔镜。
   3. 气腹针在右侧腹股沟上约2 cm处插入，用气腹针拨开附着在卵巢上的大网膜或者脂肪，使左右两侧卵巢暴露。
   4. 拔出气腹针，用眼科剪沿气腹针针眼向腹股沟方向剪0.3 cm的切口，提起腹部皮肤，将戳卡沿切口慢慢插入腹腔，拔出套管芯，换成抓钳插入腹腔。
   5. 把抓钳分口至最大，沿卵巢滑至卵巢根部夹紧托起，活动抓钳观察是否抓牢。抓牢后，吸卵人员打开负压吸引泵，在实验猴腹部抓钳的对侧插入18G吸卵针，将卵泡液吸入提前预热好的含2.5%肝素钠的TH3取卵液中，放置于15 ml 离心管内。
   6. 待3 mm以上卵泡吸完后，拔出吸卵针，撤离抓钳，抽出腹腔镜，打开戳卡排气阀，待腹腔内气体排出后，拔出戳卡。
   7. 采用结节缝合方法缝合术口，第一步用可吸收肠线将内膜缝合；第二步用不可吸收丝线将皮肤缝合。术口消毒后将动物送回饲养笼内。
   8. 及时将采集好的卵泡液送到实验室，进行后续实验。

1. 取卵结束后，向卵泡液混合物中加入 1 ml 浓度为2 mg/ml透明质酸酶的TH3溶液，使用移液枪吹吸以消化颗粒细胞。用40 μm的细胞过滤器过滤卵泡混合液，以去除血液和颗粒细胞，卵母细胞留在过滤器网膜上。
2. 将细胞滤器翻转后使用约10 ml TH3培养基向干净的6 cm培养皿中冲洗，以收集过滤器网膜上的卵母细胞。
3. 用口径约200 μm的口吸管在体视显微镜下捡取卵母细胞。将卵母细胞收集在盖满矿物油的CMRL-1066 培养基中，移入37℃ 5% CO₂培养箱中培养。

术后护理
手术后，将由专业的兽医人员进行日常护理，首先给动物保温，直至动物完全清醒，活动正常。术后三天内，每天观察动物精神状况及伤口情况，并每天注射一次镇痛药克洛芬（1 mg/kg）以及青霉素（10 万 IU/kg），第四天停药。

注意事项

1. 超排之前再次确认该猴是否有月经。
2. 打hCG时，双方确认猴号，确保无误。
3. 术后动物冬天注意保暖，放置于空调房内。
4. 动物放回笼内时取侧卧位，确认动物麻醉苏醒后再离开。
5. 为防止血液凝固，将采集卵泡液的15 ml 离心管装入振荡混合器，在抽吸过程开始后，使用振荡混合器匀速摇晃。
6. 所有取卵用的培养液需提前30分钟预热至37℃。
   

溶液配方

1. Tyrode's Albumin Lactate Pyruvate medium with HEPES (TH3)（表1）
   
   表1. Tyrode's Albumin Lactate Pyruvate medium with HEPES (TH3) 配制表
   

   成分	/100ml	/50ml	备注
   NaCl	3.329 ml	1.665 ml	200 mg/ml stock
   KCl	239 μl	119.5 μl	100 mg/ml stock
   CaCl2·2H2O	294 μl	147 μl	100 mg/ml stock
   MgCl2·6H2O	102 μl	51 μl	100 mg/ml stock
   NaH2PO4	48 μl	24 μl	100 mg/ml stock
   NaHCO3	210.6 mg	105.3 mg
   HEPES	240 mg	120 mg
   D-Glucose	90 mg	45 mg
   Sodium Pyruvate	12 mg	6 mg
   Sodium lactate (60% syrup)	0.17 ml	85 μl
   BSA	300 mg	150 mg
   penicillin-streptomycin (100X)	1 ml	500 μl
   Phenol Red (0.01%)	10 μl	5 μl
   pH	7.4

   
   
2. CMRL-1066（表2）
   
   表2. CMRL-1066 配制表
   

   	/10 ml
   CMRL-1066
   10% FBS	1 ml
   Sodium Pyruvate	0.4 mg
   Glutamine	1.5 mg
   Calcium lactate	5.5 mg
   Estradiol	1 μl
   Progesterone	750 μl