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腹腔镜引导食蟹猴胚胎移植
Laparoscopic Guided Embryo Transfer of Cynomolgus Monkey   

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摘要:胚胎移植是辅助生殖的一个关键步骤,如果此过程不成功,将导致实验猴怀孕失败。胚胎移植是指将体外受精,或者通过单精注射及其他方式得到的胚胎,移植到生理状态同步的雌性猴输卵管或子宫内,使之继续着床发育的技术。提供卵母细胞的个体称为供体,接受胚胎的个体称为受体。
胚胎移植包括:胚胎的选择、受体的判定、移植方法及妊娠诊断。胚胎选择目前主要观察卵裂球的形态及其发育时期。受体的判定,根据动物的健康状况、年龄、体重、胎次、及胚胎时期与受体子宫的同步性等综合指标,判断是否是优质受体。移植方法采用腹腔镜引导移植法。妊娠诊断用B超仪监测。

关键词: 胚胎移植, 受体, 腹腔镜

材料与试剂

  1. 不可吸收缝合线(2-0)
  2. 可吸收肠线(3-0)
  3. 75%酒精
  4. 碘酊
  5. 舒泰 50 维克贸易(上海)有限公司3597133073812
  6. 硫酸阿托品注射液(上海禾丰制药有限公司)
  7. 注射用青霉素钠/80万单位 华北制药股份有限公司
  8. 布洛芬

仪器设备

  1. 手术器械包(气腹针、戳卡、眼科剪、镊子、持针钳、止血钳、圆针、三棱针。以上物品高压灭菌备用。)
  2. 气腹机(OLYMPUS UHI-3)
  3. 高辉度光源装置(OLYMPUS CLH-250)
  4. 摄像系统(OLYMPUS OTV-SC2)
  5. 显示屏(SONY)
  6. 高纯氮
  7. 无影灯
  8. B超仪ACUSON NX3 Elite西门子

实验步骤

一、受体挑选

  1. 选择健康、无生殖道疾病的雌性猴;
  2. 年龄在4-10岁,体重3-5.5 kg较好,3 kg以下太瘦,体质相对较差,5.5 kg以上过于肥胖的动物,容易造成体内激素水平下降,内分泌失调,影响胚胎着床。
  3. 优先选择有生产(生育)史的雌性猴做受体,这样的猴有产仔及带仔经验,能提高仔猴出生存活率。
  4. 根据胚胎时期选择相对应的移植窗口期,在月经周期第13-18天、子宫内膜厚度达到2.5 mm以上时移植最佳。早期胚胎即2-4细胞时期胚胎,可选择移植给卵泡期(临近排卵的卵泡)和排卵1-2天的受体;16细胞至囊胚期的胚胎,移植给排卵1-4天的受体,一般不选择处于卵泡期的受体。
  5. 对用于超排取卵的供体实验猴,我们选择其做受体时,需要距离上次取卵时间间隔至少3个月才能使用。自体移植除外,可以在取卵后第2天进行胚胎移植。

二、受体动物准备

  1. 受体动物手术前禁食12 h。
  2. 麻醉:舒泰50,剂量4-6 mg/kg,肌肉注射。
  3. 麻醉前给药:阿托品0.1 mg/kg,皮下注射;青霉素10万单位/kg,肌肉注射。
  4. 被毛:上至肚脐上方3 cm处,下至腹股沟处,将整个肚皮的毛剔除干净。
  5. 保定:麻醉后的受体动物以头低臀高的姿势放置在手术台上,然后将四肢分别用绷带固定在手术台的四个支架上。
  6. 消毒:先用1.8-2.2%碘酊对术部进行消毒(腹部剃毛区全部消毒),待碘酊干燥后,用75%的酒精脱碘三次。
  7. 铺上一次性无菌洞巾,暴露术区。

三、手术方法

  1. 气腹针以45度角于脐轮上缘1 cm处插入腹腔,接气腹机,进气速度不超过1 L/min,腹腔内压力不超过24 mmHg。
  2. 待腹部鼓起皮肤无褶皱后,拔掉气腹针,用眼科剪沿气腹针针眼向肚脐方向剪 0.5cm 的切口,提起脐上皮肤,将戳卡先斜后垂直慢慢插入腹腔,拔出套管芯, 接通光源及显示屏,缓慢插入腹腔镜。
  3. 气腹针在右侧腹股沟上约2 cm处插入,用气腹针拨开附着在卵巢上的大网膜或者脂肪,使左右两侧卵巢暴露。
  4. 用眼科剪在卵巢对应部位的皮肤开口约1 cm,再用止血钳伸入开口处,夹住包裹卵巢的脂肪并牵引出腹腔外固定好。
  5. 拔出腹腔镜,关闭腹腔镜系统,打开无影灯照在暴露的卵巢上。
  6. 理顺输卵管,用镊子轻轻夹住喇叭口,胚胎操作人员将吸有胚胎的移植管顺喇叭口插入输卵管,吹入胚胎。
  7. 待胚胎放置后,将输卵管,卵巢小心放回腹腔复位。
  8. 采用结节缝合方法缝合术口,第一步用可吸收肠线将内膜缝合;第二步用不可吸收丝线将皮肤缝合。术口消毒后将受体送回饲养笼内。

腹腔镜介导胚胎移植示意图:


图1和图2. 腹腔镜介导下,将输卵管牵引出腹腔.


图3. 固定输卵管及喇叭口.


图4. 胚胎装入移植管;


图5. 胚胎移植入输卵管


术后护理
手术后,将由专业的兽医人员进行日常护理,首先给动物保温,直至动物完全清醒,活动正常。术后三天内,每天观察动物精神状况及伤口情况,并每天注射一次镇痛药克洛芬(1 mg/kg)以及青霉素(10万 IU/kg),第四天停药。

四、食蟹猴早期妊娠诊断
胚胎移植后23-27天可以用B超监测方法,观察到胎猴心脏跳动(图6),即可确定妊娠成功。


图6. 胚胎移植后第26天怀孕子宫及胎儿超声图像.

注意事项

  1. 术后动物冬天注意保暖,放置于空调房内。
  2. 动物放回笼内时取侧卧位,确认动物麻醉苏醒后再离开。
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Copyright: © 2023 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC.
引用格式:王燕, 许玉婷, 李春杨, 孙强. (2023). 腹腔镜引导食蟹猴胚胎移植. // 实验动物胚胎操作实验手册. Bio-101: e1010983. DOI: 10.21769/BioProtoc.1010983.
How to cite: Wang, Y., Xu, Y. T., Li, C. Y., and Sun, Q. (2023). Laparoscopic Guided Embryo Transfer of Cynomolgus Monkey. // Embryo Manipulation Manual of Laboratory Animals. Bio-101: e1010983. DOI: 10.21769/BioProtoc.1010983.
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