腹腔镜引导食蟹猴胚胎移植
Laparoscopic Guided Embryo Transfer of Cynomolgus Monkey   

材料与试剂

1. 不可吸收缝合线（2-0）
2. 可吸收肠线（3-0）
3. 75%酒精
4. 碘酊
5. 舒泰 50 维克贸易（上海）有限公司3597133073812
6. 硫酸阿托品注射液（上海禾丰制药有限公司）
7. 注射用青霉素钠/80万单位 华北制药股份有限公司
8. 布洛芬
   

仪器设备

1. 手术器械包（气腹针、戳卡、眼科剪、镊子、持针钳、止血钳、圆针、三棱针。以上物品高压灭菌备用。）
2. 气腹机（OLYMPUS UHI-3）
3. 高辉度光源装置（OLYMPUS CLH-250）
4. 摄像系统（OLYMPUS OTV-SC2）
5. 显示屏（SONY）
6. 高纯氮
7. 无影灯
8. B超仪ACUSON NX3 Elite西门子
   

实验步骤

一、受体挑选

1. 选择健康、无生殖道疾病的雌性猴；
2. 年龄在4-10岁，体重3-5.5 kg较好，3 kg以下太瘦，体质相对较差，5.5 kg以上过于肥胖的动物，容易造成体内激素水平下降，内分泌失调，影响胚胎着床。
3. 优先选择有生产（生育）史的雌性猴做受体，这样的猴有产仔及带仔经验，能提高仔猴出生存活率。
4. 根据胚胎时期选择相对应的移植窗口期，在月经周期第13-18天、子宫内膜厚度达到2.5 mm以上时移植最佳。早期胚胎即2-4细胞时期胚胎，可选择移植给卵泡期（临近排卵的卵泡）和排卵1-2天的受体；16细胞至囊胚期的胚胎，移植给排卵1-4天的受体，一般不选择处于卵泡期的受体。
5. 对用于超排取卵的供体实验猴，我们选择其做受体时，需要距离上次取卵时间间隔至少3个月才能使用。自体移植除外，可以在取卵后第2天进行胚胎移植。

二、受体动物准备

1. 受体动物手术前禁食12 h。
2. 麻醉：舒泰50，剂量4-6 mg/kg，肌肉注射。
3. 麻醉前给药：阿托品0.1 mg/kg，皮下注射；青霉素10万单位/kg，肌肉注射。
4. 被毛：上至肚脐上方3 cm处，下至腹股沟处，将整个肚皮的毛剔除干净。
5. 保定：麻醉后的受体动物以头低臀高的姿势放置在手术台上，然后将四肢分别用绷带固定在手术台的四个支架上。
6. 消毒：先用1.8-2.2%碘酊对术部进行消毒（腹部剃毛区全部消毒），待碘酊干燥后，用75%的酒精脱碘三次。
7. 铺上一次性无菌洞巾，暴露术区。
   
   
   

三、手术方法

1. 气腹针以45度角于脐轮上缘1 cm处插入腹腔，接气腹机，进气速度不超过1 L/min,腹腔内压力不超过24 mmHg。
2. 待腹部鼓起皮肤无褶皱后，拔掉气腹针，用眼科剪沿气腹针针眼向肚脐方向剪 0.5cm 的切口，提起脐上皮肤，将戳卡先斜后垂直慢慢插入腹腔，拔出套管芯， 接通光源及显示屏，缓慢插入腹腔镜。
3. 气腹针在右侧腹股沟上约2 cm处插入，用气腹针拨开附着在卵巢上的大网膜或者脂肪，使左右两侧卵巢暴露。
4. 用眼科剪在卵巢对应部位的皮肤开口约1 cm，再用止血钳伸入开口处，夹住包裹卵巢的脂肪并牵引出腹腔外固定好。
5. 拔出腹腔镜，关闭腹腔镜系统，打开无影灯照在暴露的卵巢上。
6. 理顺输卵管，用镊子轻轻夹住喇叭口，胚胎操作人员将吸有胚胎的移植管顺喇叭口插入输卵管，吹入胚胎。
7. 待胚胎放置后，将输卵管，卵巢小心放回腹腔复位。
8. 采用结节缝合方法缝合术口，第一步用可吸收肠线将内膜缝合；第二步用不可吸收丝线将皮肤缝合。术口消毒后将受体送回饲养笼内。

术后护理
手术后，将由专业的兽医人员进行日常护理，首先给动物保温，直至动物完全清醒，活动正常。术后三天内，每天观察动物精神状况及伤口情况，并每天注射一次镇痛药克洛芬（1 mg/kg）以及青霉素（10万 IU/kg），第四天停药。

四、食蟹猴早期妊娠诊断
胚胎移植后23-27天可以用B超监测方法，观察到胎猴心脏跳动（图6），即可确定妊娠成功。


图6. 胚胎移植后第26天怀孕子宫及胎儿超声图像.

注意事项

1. 术后动物冬天注意保暖，放置于空调房内。
2. 动物放回笼内时取侧卧位，确认动物麻醉苏醒后再离开。