猴体细胞核移植
Somatic Cell Nuclear Transfer of Monkeys   

材料与试剂

实验耗材

1. 15 ml离心管（Corning，catalog number：430791）
2. 18-G卵泡吸取针（Olympus，catalog number：G19715）
3. 移液枪(Eppendorf)
4. 40 μm过滤器（FALCON，catalog number：352340）
5. 3.5 cm培养皿（Coring，catalog number：430165）
6. 6 cm培养皿（Coring，catalog number：430166）
7. 10 cm培养皿（Coring，catalog number：430167）
8. 口吸管（北京正天，catalog number：BJ-40）
9. 毛细玻璃管（Sutter Instrument，catalog number：B100-75-10）

1. 0.25% Trypsin-EDTA（Gibco,catalog number：25200-072）
2. Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)（Gibco，catalog number：11965-092）
3. Dimethylsulfoxide (DMSO)（Sigma，catalog number：D2650）
4. PVP（Sigma，catalog number：PVP360）
5. 细胞松弛素 B（cytochalacin B）（Sigma，catalog number：C6762）
6. Fusogenic viral envelop (HVJ-E) (COSMO BIO CO. LTD)
7. Ionomycin（碧云天，catalog number：S1672）
8. 6-Dimethylaminopurine（Sigma，catalog number：D2629）
9. 矿物油（Sigma，catalog number：M8410）
10. 肝素钠（上海三杰，catalog number：091201）
11. Hyaluronidase（Sigma，catalog number：H3884）
12. PBS（Gibco，catalog number：10010-023）
13. Tyrode's Albumin Lactate Pyruvate medium with HEPES (TH3) （见溶液配方）
14. Hamster embryo culture medium-9 (HECM-9)（见溶液配方）
15. CMRL-1066（见溶液配方）
16. 成纤维细胞培养基（见溶液配方）

仪器设备

1. 振荡器 （Kylin-Bell Lab Instruments, catalog number：QH-600）
2. 腹腔镜系统
3. 腹腔镜（Olympus, model：OVT-SC2）
4. 光源（Olympus,model：CLH-250）
5. 显示器（Sony）
6. 负压吸卵系统（Cook）
7. 管式加热器（Cook）
8. 体视显微镜(Olympus，model：SZX7)
9. 倒置显微镜(Olympus,model：IX-83).
10. 培养箱（Thermo Scientific，model：Forma 3111、Forma 371）
11. 离心机 (Eppendorf centrifuge，model：5702 )
12. 拉针仪(Sutter Instrument，model：P97)
13. 锻针仪(Narishige,model：MF-900)
14. 磨针仪 (Narishige,model：EG-400)
15. 激光系统(Hamilton Thorne)
16. 压电冲击驱动系统(Prime Tech).
17. 纺锤成像显微系统(Oosight)
18. 显微操作臂(Narishige)
19. 微量注射器（Narishige IM-9B）
    

实验步骤

一、卵母细胞的收集

1. 在15 ml离心管中吸入2-3 ml含2.5%肝素的TH3培养基，用37 °C管式加热器预热。将18-G卵泡抽吸针管端塞进 15 ml 离心管中。在腹腔镜系统将滤泡吸取针插入腹腔后点吸卵巢上面的明显卵泡，为防止血液凝固，将采集卵泡液的15 ml离心管装入振荡混合器，在抽吸过程开始后，使用振荡混合器全程运行。
2. 取卵结束后，向卵泡液混合物中加入1 ml透明质酸酶(2 mg/ml)，使用移液枪吹吸以消化颗粒细胞。用40 μm的细胞过滤器过滤卵泡混合液，以去除血液和颗粒细胞，卵母细胞留在过滤器网膜上。
3. 将细胞滤器翻转后使用约10 ml TH3培养基向干净的6 cm培养皿中冲洗，以收集过滤器网膜上的卵母细胞。
4. 用口径约300 μm的口吸管在体视显微镜下捡取卵母细胞。收集的卵母细胞在 CMRL-1066培养基中培养。

二、猴子成纤维细胞的准备
猴子成纤维细胞既可以来自食蟹猴流产的胎儿（步骤1-3），也可以来自出生后的食蟹猴（步骤4-6）。

1. 对于猴子胎儿成纤维细胞，将胎儿的皮肤全部剥皮并切成小块。
2. 将小块组织放入含有DNase (1 mg/ml)和胶原酶IV (0.5 mg/ml)的细胞培养液中，在 37 °C 5% CO₂中消化4 h，加入细胞培养液终止消化。收集细胞悬液，用细胞过滤器过滤细胞悬浮液以排除未消化的细胞团。得到单个成纤维细胞，将成纤维细胞以适当密度种植于10 cm培养皿中，记录传代数为P0。
3. 第二天，检查培养皿，以确保成纤维细胞贴壁生长。及时更换细胞培养液，直到细胞覆盖培养皿80%-90%的面积，0.25%胰蛋白酶消化后用10% DMSO和90% FBS在冷冻器中冻存细胞，隔天转移液氮中长期保存直到使用。
4. 对于出生的成体猴子，从麻醉的猴子身上切下一小块皮肤。用含青霉素和链霉素的 PBS清洗三次，然后切成1-2 mm³小块。
5. 将这些组织放入6 cm培养皿中，加入适量的细胞培养基，使所有的皮肤组织都被培养液覆盖，同时不会有切碎的皮肤组织漂浮在培养液中，等待成纤维细胞爬出皮肤组织。
6. 当成纤维细胞达到培养皿80%的面积时，用0.25%胰蛋白酶消化成纤维细胞 1 分钟。200 × g离心3 min 后，将成纤维细胞传代至10cm的培养皿中。
7. 细胞覆盖培养皿80%-90%的面积时，0.25% 胰蛋白酶消化后用10% DMSO和 90%胎牛血清在冷冻器中冻存细胞，隔天转移液氮中长期保存直到使用。

三、成纤维供体细胞准备

1. 从液氮中取1管成纤维细胞，在37 °C水浴中快速解冻。立即将细胞转移到15 ml 的离心管中。加入3-5 ml 细胞培养基，轻轻吹打混匀。
   200 × g 离心 3 min 后弃上清。重新加入培养基混匀细胞，将细胞按不同的浓度梯度传代于 48 孔板的2-4孔上，密度梯度为：5×10⁴ 孔、3×10⁴ 孔、2×10⁴ 孔和 1×10⁴孔。
2. 将解冻后的细胞在37 °C 5% CO₂ 中培养，通过细胞生长接触致使大量细胞停留在 G0 期。使用前，用 0.25%胰蛋白酶消化成纤维细胞，37 °C孵育1 min。然后加入2倍体积的细胞培养基终止消化。
3. 将细胞混合液200 × g 离心 3 min，弃上清。使用20 μl PBS吹吸细胞沉淀至混合均匀，使用细胞悬浮液进行后续核注射。
   
   
   

四、体细胞核移植

1. 在实验前使用P97拉针仪将毛细管玻璃(B100-75-10)拉制合适的长度和并使用MF-900锻针仪准备去核显微操作针注射针和RNA注射针和持卵针，去核针外径8-10 μm，内径 7-9 μm，用1 ml注射器将水银（约2 mm）装入去核移液管后端；用于
   注射成纤维细胞的注射针外径为16-18 μm，内径 15-17 μm，之后使用EG-400微型磨针仪倾斜45°磨制体细胞注射针；RNA注射针的制备和去核针相似，在外径为3 μm处断口而后用同样的方法加入2 mm左右的水银柱；持卵针的外径为100 μm，内径为10 μm；以上的针在制备后使用MF-900锻针仪打弯至合适仪器的角度。
2. 准备一个玻璃底的操作碟，操作液是CB的终浓度为5 μg/ml的TH3溶液。并滴加 3 μl的10% PVP 液体用来清洗注射针，用矿物油覆盖所有的溶液。
3. 将显微操作臂和去核针调至适当位置，使用较大电压脉冲高等速度(5-6)和功率(4-5)在PVP液滴中清洗操作针，将10个MII左右的卵母细胞放入操作滴液中，采用纺锤体成像显微系统观察卵母细胞的纺锤体。在视线下，纺锤看起来像一个明亮的小薄片。
4. 用持液针将卵母细胞固定在适当位置，并将纺锤体和去核针调整到同一水平面。使用压电装置以中等速度(2-3)和功率(2-3)打破透明带。携带尽可能少的细胞质将纺锤体吸出（图1. a，b，c）。
5. 在一个操作液滴加适量2.5 mol/L融合病毒包膜(HVJ-E)，将供体细胞滴加到这个操作滴中。将去核的卵母细胞移入其他操作滴中，用激光破膜仪在透明带打出一个通道。用注射针管吸取病毒液滴的供体细胞通过该通道注射进入卵母细胞（图1. d，e），之后在 37 °C、5% CO₂条件下将操作的卵母细胞移入预平衡的HECM-9培养皿中。
6. 细胞融合1-2 h后，将胚胎移入含5 mM ionomycin的TH3培养基中5 min，再移入激活液（10 μM TSA和2 mM 6-Dimethylaminopurine的HECM-9 溶液）5 h。激活后，将SCNT胚胎移入TSA终浓度为10 μM的HECM-9培养皿 3-5 h，再转回HECM-9培养皿中。
7. 激活6小时后，对胚胎进行RNA注射，RNA注射针放入PVP滴液中清洗。将激活的胚胎转移到操作滴中，注入10个pL Kdm4d mRNA，其浓度在1,000 ng/μL以上（图1. f）。将操作后的胚胎在HECM-9中培养，37 °C，5% CO₂，等待胚胎移植。

溶液配方

1. Tyrode's Albumin Lactate Pyruvate medium with HEPES (TH3)（表1）
   
   表1. Tyrode's Albumin Lactate Pyruvate medium with HEPES (TH3) 配制表
   

   成分	/100ml	/50ml	备注
   NaCl	3.329 ml	1.665 ml	200 mg/ml stock
   KCl	239 μl	119.5 μl	100 mg/ml stock
   CaCl2·2H2O	294 μl	147 μl	100 mg/ml stock
   MgCl2·6H2O	102 μl	51 μl	100 mg/ml stock
   NaH2PO4	48 μl	24 μl	100 mg/ml stock
   NaHCO3	210.6 mg	105.3 mg
   HEPES	240 mg	120 mg
   D-Glucose	90 mg	45 mg
   Sodium Pyruvate	12 mg	6 mg
   Sodium lactate (60% syrup)	0.17 ml	85 μl
   BSA	300 mg	150 mg
   penicillin-streptomycin (100X)	1 ml	500 μl
   Phenol Red (0.01%)	10 μl	5 μl
   pH	7.4

   
   
2. HECM-9（表2）
   
   表2. HECM-9 配制表
   

   成分			/100ml		终浓度
   NaCl			0.6639 g		113.6 mmol/L
   KCl			0.0224 g		3 mmol/L
   CaCl2·2H2O			0.0279 g		1.9 mmol/L
   MgCl2·6H2O			0.0102 g		0.5 mmol/L
   NaHCO3			0.2100 g		25 mmol/L
   Sodium lactate (60% syrup)			0.0504 g		4.5 mmol/L
   PVA			0.01 g		0.1 mg/ml
   1 mol/L HCl			0.14 ml		1.4 mmol/ml
   11 AA with Pantothenate			1 ml
   100X AA stock
   成分	MW	100X 母液浓度		终浓度
   Taurine	125	50 mmol/L		0.5 mmol/L
   Asparagine	132	1 mmol/L		0.01 mmol/L
   Cysteine	121	1 mmol/L		0.01 mmol/L
   Histidine	155	1 mmol/L		0.01 mmol/L
   Lysine	146	1 mmol/L		0.01 mmol/L
   Proline	115	1 mmol/L		0.01 mmol/L
   Serine	105	1 mmol/L		0.01 mmol/L
   Aspartic acid	133	1 mmol/L		0.01 mmol/L
   Glycine	75	1 mmol/L		0.01 mmol/L
   Glutamic acid	147	1 mmol/L		0.01 mmol/L
   Glutamine	146	20 mmol/L		0.2 mmol/L
   Pantothenate	238	0.3 mmol/L		3 μmol/L

   
   
3. CMRL-1066（表3）
   
   表3. CMRL-1066 配制表
   

   	/10 ml
   CMRL-1066
   10% FBS	1 ml
   Sodium Pyruvate	0.4 mg
   Glutamine	1.5 mg
   Calcium lactate	5.5 mg
   Estradiol	1 μl
   Progesterone	750 μl

   
   
   
4. 成纤维细胞培养基（表4）
   
   表4. 成纤维细胞培养基配制表
   

   成分	终浓度
   FBS	15%
   penicillin	100 IU/ml
   streptomycin	100 IU/ml
   Glycine	0.1 mM
   L-Alanine	0.1 mM
   L-Asparagine	0.1 mM
   L-Aspartic acid	0.1 mM
   L-Glutamic Acid	0.1 mM
   L-Proline	0.1 mM
   L-Serine	0.1 mM
   glutamax	2 mM
   sodium pyruvate	1 mM