摘要:Aprataxin(APTX)是一种神经退行性疾病相关蛋白,其功能障碍可导致眼球运动失用症(AOA1)的共济失调。在DNA修复过程中,APTX可在DNA缺口或断裂处催化5' -AMP端腺苷酸基团的亲核释放。我们解析了裂殖酵母中APTX直系同源物Hnt3蛋白与双链DNA复合物的晶体结构。为了更好的确定Hnt3蛋白与DNA的互作机制,我们采用了表面等离子共振技术(SPR),使用Biacore T100仪器,将生物素化修饰的双链DNA固定到SA芯片作为固定相,检测Hnt3母体及突变体与DNA的结合曲线和亲和力,根据亲和力的变化,确定Hnt3上与DNA结合的关键位点。该项工作中,SPR技术与复合物晶体结构相呼应,深入揭示了APTX发挥功能的分子机制。
关键词: 表面等离子共振技术, APTX, Hnt3, 蛋白质-DNA互作, SA芯片
材料与试剂
- S系列SA芯片(Cytiva,BR100531)
- Tris、HCl、NaCl、NaOH、β-巯基乙醇、Tween 20(Sigma-Aldrich公司)
- 酵母Hnt3全长蛋白、Hnt3∆32 (残基33-232)截短体及多种突变体,储存在缓冲液(20 mM Tris-HCl pH8.0,100 mM NaCl,5 mM β-巯基乙醇)中。蛋白质的表达纯化方法参见文献1。Hnt3全长232个氨基酸,分子量为26.9 kD;Hnt3∆32 (残基33-232)截短体,分子量为23.6 kD;其余突变体C130A,H138A,S142A,T212A,F34A,K161A均为Hnt3∆32的氨基酸点突变。蛋白样品均为新鲜纯化浓缩,浓度为~200 μM。
- DNA由生工生物工程(上海)股份有限公司合成,合成两条单链核苷酸。
其中一条链3′端在合成时加上生物素标记(5'-ATTCCGATAGTGAC-3'-biotin),另一条为其互补链,无生物素标记(5'-GTCACTATCGGAAT-3')。双链DNA(dsDNA)分子量为8.9 kD。 - 其他耗材:1.5 mL EP管, 1 mL, 200 µL, 10 µL枪头均为Axygen公司产品。
- 0.22 μm微孔滤膜
仪器设备
- Biacore T100(GE, Healthcare)
- 超纯水仪(Millipore)
实验步骤
一、Biacore实验前准备
- 双链DNA的制备:将合成的两条单链DNA分别按照100 μM浓度溶解在10 mM Tris–HCl (pH 8.0) ,50 mM NaCl 缓冲液中,各取50 µL单链DNA溶液混合至EP管,将EP管置于95 ℃ PCR仪加热变性5分钟,然后缓慢冷却2小时左右至25 ℃退火,在这个过程中两条单链DNA互相配对形成双链,得到100 µL终浓度为50 μM的双链DNA。
- 运行缓冲液的制备:运行缓冲液配方为20 mM Tris-HCl, pH7.5, 100 mM NaCl和0.005% (v/v) Tween 20。配制过程如下:首先进行储液配制。1 M Tris-HCl储液制备:取121.14 g Tris溶解在1L纯水中用HCl调节pH到7.5,室温储存;1 M NaCl储液制备:取58.5 g NaCl溶解在1 L纯水中,室温储存。运行缓冲液使用前新鲜配制,取20 mL 1 M Tris-HCl母液,100 mL 1 M NaCl母液,0.05 mL的Tween 20,加纯水定容至1 L,使用前0.22 μm微孔滤膜抽滤。SPR实验中,DNA和蛋白的稀释均用此缓冲液。
- 蛋白样品和DNA均离心处理:12,000× g离心5分钟,将粘附管壁的溶液和样品离心下来,去除气泡和杂质,以免对仪器信号造成影响。
- 配制含50 mM NaOH和1 M NaCl的溶液。先配制0.5 M NaOH母液:称取2 g NaOH粉末,用100 mL纯水溶解,0.22 μm微孔滤膜过滤备用。4 M NaCl母液:称取23.36 g NaCl粉末,用100 mL纯水溶解,0.22 μm微孔滤膜过滤备用。取100 μL 0.5 M NaOH和250 μL 4 M NaCl到650 μL纯水,用移液器多次吹打,离心去掉气泡,得到1 mL含50 mM NaOH和1 M NaCl的溶液。
- 点击undock,将维护芯片更换为S系列SA芯片,放入500 mL运行缓冲液,Prime。仪器实验温度维持25 ℃。
二、DNA固定
根据核酸和蛋白的分子量计算,固定量为40 RU时,全长蛋白的Rmax为121 RU(40*26.9/8.9),截短体为106 RU,是比较好的实验条件。将DNA用缓冲液稀释至50 nM。选择自动化程序固定,Run Wizard→Surface Preparation→immobilization。Chip type选择SA,Flow cell1(Fc1)空白,Flow cell2(Fc2)目标固定量设置为40 RU(图1)。该程序中,系统流速为10 μL/min,芯片表面将用含50 mM NaOH和1 M NaCl的溶液,进样三次,每次60 s(图2A),将芯片表面多余的Streptavidin蛋白去掉。Fc2 DNA进样1 ul,达到要求,自动停止进样,程序显示固定38.2RU(图2B)。
我们将DNA固定的部分信号放大,发现进样前后其实只有17 RU的信号上升,由于基线漂移,系统计入的固定量更高(图2C)。于是我们用Manual Run模式,加入DNA 20 s,再次固定DNA 22.8 RU(图2D),总体固定量达到40 RU。
图1. SA芯片固定DNA的程序设定.
我们将DNA固定的部分信号放大,发现进样前后其实只有17 RU的信号上升,由于基线漂移,系统计入的固定量更高(图2C)。于是我们用Manual Run模式,加入DNA 20 s,再次固定DNA 22.8 RU(图2D),总体固定量达到40 RU。
图2. SA芯片固定DNA过程.
A. 空白通道Fc1三次含50 mM NaOH和1 M NaCl的溶液处理;B. 实验通道Fc2三次含50 mM NaOH和1M NaCl的溶液处理,之后固定DNA;C. Fc2进样DNA时的局部放大图;D. 手动模式补加DNA。2920为DNA编号。
三、分析物测试条件摸索
- 分析物是否有结合:因为预估亲和力不会太强,先配25 μM Hnt3全长蛋白,测试其是否结合DNA、结合的模式以及反应信号的高低。采用Manual Run模式,设置30 μL/min流速,进样60 s,结合信号为106 RU,几乎快达到理论Rmax (121 RU) (图3A)。结合曲线显示Hnt3与DNA属于快结合快解离,不需要再生,进样时间设置60 s即可。
- 摸索实验浓度梯度:选择构建的突变体是在结构中Hnt3与DNA有互作的氨基酸,推测会造成亲和力的下降。测试50 μM Hnt3、Hnt3∆32 及突变体C130A,H138A,S142A,T212A,F34A,K161A分别与DNA的结合,条件仍然为30 μL/min流速,进样1 min。Hnt3信号与25 μM对比,增长不多,判断达到饱和,可考虑设置50 μM为Hnt3亲和力测试时的最高浓度。Hnt3∆32、C130A、H138A和S142A的结合信号比Hnt3低一些,再结合母液浓度,考虑设置100 μM为亲和力测试时的最高浓度。F34A、K161A和T212A结合信号只有10 RU和38 RU,说明亲和力非常弱,结合母液浓度,很难做更高浓度梯度(图3B)。
图3. Hnt3、Hnt3∆32 及突变体与DNA结合的初步结果.
A. 25 μM Hnt3与DNA的结合曲线;B. 50 μM分析物与DNA的结合曲线。图中Hnt3(33-232)代表Hnt3∆32。上述曲线均为扣减Fc1背景信号后的Fc2-1信号。
四、亲和力实验方法的建立
根据前期实验结果,确定了亲和力测定的实验条件(图4):控制软件选择Run Wizard→Kinetics/Affinity→Flow path 2-1;3个startup cycles;实验条件为:流速30 μL/min,进样60 s(C130A因为样品量少,进样30 s),解离60 s;样品浓度梯度Hnt3为0,0.39,0.78,1.56,3.12,6.25,6.25,12.5,25,50 μM(6.25 μM重复一次),Hnt3∆32、C130A、H138A和S142A为0,1.56,3.12,6.25,12.5,25,50,100 μM。样品会同时流过Fc1和Fc2,减去对照通道信号的Fc2-1将会用来计算亲和力。
五、样品准备和上机
Startup cycles和0浓度均用运行缓冲液,蛋白用运行缓冲液对半梯度稀释,程序要求体积为98 μL(1.5 mL EP管),考虑到移液器误差和蒸发因素,每个样品浓度按110 μL配制,Hnt3 6.25 μM因为重复,体积200 μL。稀释完后12,000× g离心5分钟,剪掉EP管盖子,放到Sample Rack对应的位置。
图4. 亲和力测定程序设置.
六、数据分析
本次实验数据处理软件为Biacore T100 Evalutaion Software(Versions2.0)。由于Hnt3与DNA的互作属于快结合快解离,因此选择“Steady State Affinity”模型。过程如下:用Biacore T100 Evalutaion Software打开数据,点击Kinetics/Affinity,选择Surface bound,选择合适的数据包括零浓度,点击“Next”,软件会自动扣减零浓度。点击“Affinity”,软件会计算进样结束前4 s的结合信号。点击“Next”,Model选择“Steady State Affinity”,点击“Fit”,程序会给出拟合结果。
实验注意要点
- 生物素化DNA固定到SA芯片时,如果在自动化程序中设置了目标固定量,仪器会自动进样,达到目标信号即停止。当设置的固定量比较高时没问题,但当数值比较小时,误差会比较大。原因是芯片表面会先用含50 mM NaOH和1 M NaCl溶液处理,之后基线会向上漂移,系统记录的固定量会包括一部分漂移信号,导致固定量高。
- 如果自动固定没有达到预期,需要补加生物素化样品时,不能使用软件里SA芯片的自动化固定程序。因为该程序默认了三次含50 mM NaOH和1 M NaCl溶液处理,会破坏之前固定的样品活性。此时,推荐Manual Run手动进样模式(Biacore T100)。如果是Biacore 8K仪器,没有手动进样模式,可以在固定程序里将前处理命令删除。
- 生物素化DNA固定到SA芯片,和蛋白氨基偶联相比,过程简单,也没有样品活性率的问题。
- 在蛋白-DNA的SPR互作分析中曾多次出现快结合快解离的模式。此类实验不需要摸索再生条件,相对简单。它的主要问题是找到合适的浓度梯度,因为用“steady state affinity”模型拟合时,出现饱和趋势才能获得准确的Rmax,继而计算出的亲和力数据才会准确。有些亲和力特别弱的,受制于样品浓度,可能无法得到可靠的亲和力数据。另外,当分析物所用浓度较高时,要注意观察对照通道是否产生非特异结合信号。
结果与数据分析
Hnt3突变体F34A、K161A在50 μM时只有10 RU信号(图3B),亲和力大大减弱,结合母液浓度,很难做更高浓度梯度来计算亲和力,所以我们给出了“ND”(not determined)的结论(表1)。在Hnt3-DNA复合物晶体结构中,残基 Phe34 与核苷酸形成堆叠相互作用,对暴露的碱基进行末端加帽,发挥关键的作用。F34A突变体表现出 DNA 结合亲和力明显下降,提示Phe34在识别DNA的过程中具有必不可少的作用。Lys161通过与核苷酸相互作用固定 DNA 骨架的裂隙,突变体将严重影响Hnt3与DNA之间的相互作用1。
突变体T212A在50 μM时结合信号为38 RU左右(图3B),高于F34A、K161A,低于其它突变体,说明它的亲和力介于它们之间,受限于样品量,该样品没有做浓度梯度,但根据50 μM时的结合信号,可以做排序。晶体结构中,Thr212与DNA的磷酸骨架直接相互作用,结合SPR结果,说明该突变体影响了Hnt3与DNA之间的相互作用,重要性弱于Phe34和Lys161。
Hnt3、Hnt3∆32、C130A、H138A和S142A都通过“steady state affinity”模型得到了亲和力数据(图5,表1)。全长Hnt3蛋白与DNA结合时的亲和常数Kd为4.26 μM,与其他突变体相比具有最高的亲和力,是Hnt3∆32与DNA亲和力的4倍,表明N端截短1-32残基可以影响Hnt3蛋白与DNA的结合。C130突变成Ala,亲和力为29.4 μM,与Hnt3∆32相比亲和力下降了1.7倍,说明其在蛋白质-DNA中有一定作用。H138、S142突变成Ala,亲和力为11.05和16.94 μM,变化不大,说明这两个氨基酸不是Hnt3与DNA互作的关键氨基酸。
表1. Hnt3、Hnt3∆32及其突变体与DNA结合的亲和力
Protein | Binding affinity Kd(μM) | Concentration range(μM) | Rmax (RU) | Chi² (RU²) |
Hnt3 | 4.23 | 0.39-50 | 124 | 13.9 |
Hnt3∆32 | 17.16 | 1.56-100 | 101 | 2.02 |
C130A | 29.4 | 1.56-100 | 79.84 | 4.93 |
H138A | 11.05 | 1.56-100 | 81.55 | 8.06 |
S142A | 16.94 | 1.56-100 | 89.52 | 6.14 |
T212A | NDa | 50 | | |
F34A | NDa | 50 | | |
K161A | NDa | 50 | | |
aND, not determined.
图5. Hnt3、Hnt3∆32、C130A、H138A和S142A与DNA的亲和力拟合结果.Hnt3(33-232)代表Hnt3∆32。
致谢
该文章与我们之前发表在Nature structural&molecular biology(龚勇、朱德裕等,2011,DOI:10.1038/nsmb.2145)上的研究有关。
参考文献
- Gong, Y., Zhu, D., Ding, J., Dou, C. N., Ren, X., Gu, L., Jiang, T. and Wang, D. C. (2011). Crystal structures of aprataxin ortholog Hnt3 reveal the mechanism for reversal of 5'-adenylated DNA. Nat Struct Mol Biol 18(11): 1297-1299.
Copyright: © 2023 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC.
引用格式:刘雪静, 高靓, 朱德裕, 曹鹏, 龚勇, 陈媛媛. (2023). 应用Biacore技术检测Hnt3蛋白与双链DNA的亲和力.
Bio-101: e1011002. DOI:
10.21769/BioProtoc.1011002.
How to cite: Liu, X. J., Gao, L., Zhu, D. Y., Cao, P. and Chen, Y. Y. (2023). Application of Biacore Technology to Detect the Affinity of Hnt3 Protein to Double-stranded DNA.
Bio-101: e1011002. DOI:
10.21769/BioProtoc.1011002.