利用Biacore 8K从哺乳动物细胞上清中快速筛选高亲和力抗体
Rapid Screening of High-affinity Antibodies from Mammalian Cell Supernatants Using Biacore 8K   

引言

新冠病毒为了适应不同的环境，在不断地进化，因此具有高度变异性。其高度变异的特性不仅会造成病毒具有强大的传播能力，还对疫苗以及抗病毒治疗药物、抗体产生巨大的威胁。目前发现上市的许多抗体对新毒株失去了结合或者中和能力，因此，快速筛选新抗体对于新冠肺炎的治疗具有重要意义。由于从新冠康复患者血清中筛选抗体周期较长，因此我们以结构为基础，在现有已报道抗体的基础上进行单点氨基酸突变以达到快速筛选抗体的目的。我们构建了大量突变体，利用传统筛选方法只能定性分析抗体与抗原是否结合，无法得到抗体与抗原的亲和力，亦无法比较不同抗体之间的亲和力差异，本文利用Biacore8K对点突变的抗体进行快速筛选，并可以比较不同抗体的亲和力，从而可以筛选出高亲和力的抗体。

材料与试剂

1. 吐温20（VETEC，catalog number： V900548-500 mL）
2. DMEM 培养基（Gibco，catalog number：C11995500BT 500 mL）
3. 悬浮细胞培养基（北京义翘神州科技股份有限公司，catalog number：M293TII）
4. 细胞计数板（Marienfeld，catalog number：0650030）
5. 胎牛血清（Gibco，catalog number：10437-028）
6. 12孔细胞培养板（Corning，catalog number：3513）
7. 0.22 µm微孔滤器（millipore，catalog number：SLGVR13SL）
8. 0.22 µm微孔滤膜（水系）（金晶，catalog number：QYCE-006）
9. 1 mL一次性注射器（江苏治宇医疗器材有限公司：规格 0.45 × 16RWLB）
10. 5 mL一次性注射器（江苏治宇医疗器材有限公司：规格 0.6 × 25RWLB）
11. S 系列 Protein A传感芯片（Cytiva，catalog number：29127555）
12. 10× PBS缓冲液（北京索莱宝科技有限公司，catalog number：P1022）
13. 293T细胞转染试剂PEI（上海懋康生物科技有限公司，catalog number：MX2202）
14. 293F细胞转染试剂（北京义翘神州科技股份有限公司，catalog number：STF02）
15. 96孔板（Greiner，catalog number：650101）
16. His纯化柱（Cytiva，catalog number：HisTrap HP 17524801）
17. 10KDa超滤管（Millipore，catalog number：UFC901096）
18. 分子筛纯化柱（Cytiva，catalog number：Hiload™ 16/600 Superdex™ 200 pg）
19. 咪唑（普西唐，catalog number：I50001-1KG）
20. 补料液（北京义翘神州科技股份有限公司，catalog number：M293-SUPI）
21. 一步法快速配胶试剂盒12%（诺唯赞，catalog number：E304-01）
    

仪器设备

1. 贴壁细胞培养箱（Thermo Scientific, Model：STERI-CYCLE）
2. 悬浮细胞培养箱（CRYSTAL, Model：IS-RDS3C）
3. 蛋白纯化仪（GE Healthcare，Model：ÄKTATM pure）
4. 微量冷冻离心机（Thermo Scientific, Model：Fresco 21）
5. 水平浓缩离心机（HITACH, Model: CF5RE）
6. 高速冷冻离心机（HITACH, Model: CR22N）
7. 分子相互作用分析仪（Cytiva, Model：Biacore 8K）
8. 微量分光光度计（Thermo Scientific，Model：Nanodrop2000）
9. 生物安全柜（北京东联哈尔仪器制造有限公司 Model：CLASS II TYPE A2）
10. 蠕动泵（LongerPump，Model：BT100-2J）
    

实验步骤

一、实验前准备

1. 溶液配置
   1. PBST：1,000 mL 1× PBS中加入500 μL吐温20，混匀后用0.22 μm滤膜抽滤并高压灭菌。
   2. 10 mM甘氨酸pH 1.5：称量0.075g甘氨酸加入80 mL去离子水中，待甘氨酸溶解后用HCl调整pH为1.5，定容至100 mL，0.22 μm滤膜过滤后备用。
   3. His柱洗脱A液：取100 mL 10× PBS，用去离子水定容至1 L，0.22 μm滤膜抽滤备用。
   4. His柱洗脱B液：称量68.08 g咪唑并加入800 mL PBS混匀，用磷酸调整pH至7.2–7.4，用PBS定容至1 L，0.22 μm滤膜抽滤备用
   5. 5× loading buffer：称量SDS 0.5 g，溴酚蓝25 mg，加入2.5 mL甘油，1.25 mL 1 M Tris-HCl（pH 6.8），加入去离子水溶解以后定容至5 mL，分装后于4 °C保存。
   6. 5×loading buffer（+DTT）:配置方法参照1.5，使用前按照1%加入1 M DTT（v/v）。
   7. 考马斯亮蓝染色液：称量考马斯亮蓝R250 1 g于1 L烧杯中，加入450 mL无水乙醇，100 mL冰醋酸，加水定容至1 L并于室温保存。
   8. 脱色液：无水乙醇250 mL，冰醋酸500 mL，加水定容至5 L，室温保存。
2. 抗体制备
   1. 细胞准备：以10 cm细胞盘为例。转染前一天，取出一盘状态良好且长满的293T，吸出细胞上清并用PBS轻柔的将细胞洗两遍以去除培养基中的血清，移除PBS，加入1 mL 胰酶消化。消化的过程中可以将细胞置于显微镜下观察，待细胞与细胞间出现缝隙变圆后，轻轻拍打培养皿将细胞打散，立刻加入8 mL含有10 %血清的培养基以终止消化。将细胞1:3接种于12孔板，即取3 mL细胞悬液，加入9 mL 10%血清的培养基，混匀后每孔加入1 mL 细胞悬液，37 ℃，5% CO₂培养箱中孵育过夜。
   2. 质粒转染：次日细胞贴壁并伸展开时进行转染。（以下为1孔所需质粒及PEI的量）
   3. 将1 μg抗体轻链及重链质粒（质量比3:2）混合，加入100 μL DMEM，混匀静置5 min。
   4. 将3 μg 转染试剂PEI（母液为1 mg/mL）加入100 μL DMEM中，混匀静置5 min。
   5. 将质粒与PEI混合，静置10 min后缓慢加入孔中。
   6. 4–6 h后将上清吸出，每孔缓慢轻柔地加入1 mL无血清DMEM培养基，于37 ℃ 细胞培养箱中培养48–72 h。
   7. 上清收集：将每孔中的细胞上清吸出至1.5 mL EP管，10,000× g，4 ℃，离心10 min，吸出上清，于4 ℃保存备用。
3. 分析物抗原制备
   （1）抗原表达：
   1. 构建pCAGGS-RBD-his表达质粒。随着新冠病毒的变异及进化，目前病毒对早期的许多抗体产生了逃逸，因此我们用目前流行株新冠病毒XBB1.5毒株的RBD进行抗体的筛选。优化(for Homo sapiens(Human)) 并常规合成两端含有酶切位点EcoRⅠ和XhoⅠ的RBD基因，通过酶切位点将SARS-CoV-2 XBB.1.5 RBD序列连接到pCAGGS载体上，制备重组pCAGGS-RBD-his表达质粒。
   2. 293F细胞的培养与传代。选用2 L的螺口细胞培养瓶，每瓶400 mL 培养液。293F细胞于37 ℃，5% CO₂培养箱中振荡培养，转速150 rpm。待密度至4 × 10⁶/mL时可进行传代，传代时将密度调整至0.5 × 10⁶/mL，细胞增长速度约为一天增长一倍。
   3. 293F细胞转染的准备：转染前吸取少量细胞于显微镜下计数，并观察细胞状态是否良好。用培养基将细胞进行稀释，使细胞密度为2 × 106/mL，终体积为400 mL/瓶，共2瓶，37 ℃，5% CO₂培养箱中150 rpm振荡培养5 h后进行转染。
   4. 稀释质粒（800 mL细胞用量）：20 mL 150 mM NaCl + 0.8 mg质粒，温和混匀，静置5 min。
   5. 稀释转染试剂（800mL细胞用量）：16 mL 150 mM NaCl + 4 mL 转染试剂STF02，温和混匀，静置5 min。
   6. 将上述转染试剂加入质粒中，轻柔混合后，静置10 min。质粒、转染试剂及150 mM NaCl的量可根据细胞体积按比例增加或者减少，大约0.1 mg质粒对应100 mL细胞。
   7. 将混合液加入细胞中，并将细胞在37 ℃，5% CO₂培养箱中振荡培养，转速150 rpm。分别在转染24、72小时后加补料液35 mL/L。该补料液含有细胞生长所需的氨基酸，无机盐等必需营养成份，可大量提高细胞的蛋白和抗体的产量。
      转染第五天收集细胞上清，12,000× g，4 ℃ 离心20 min以上，去除细胞，用0.22 μm滤膜过滤细胞上清。
   （2）His柱亲和纯化：
   蠕动泵上样：（因细胞上清量较大，上样时间长，为避免蛋白失活，3(1)a–3(1)b步骤需在4 ℃操作。如果纯化仪位于4 ℃冷库或层析柜中，可省略3(1)a–3(1)b，将His纯化柱连接在纯化仪上，直接上样）。
   1. 将蠕动泵卡子卡在蠕动泵上并将软管一端放入去离子水中，打开蠕动泵开关，调节流速小于等于2 mL/min，将His纯化柱连接在软管上。
   2. 将软管一端依次放入4–5倍柱体积的水及4–5倍柱体积的PBS中以平衡His纯化柱。
   3. 将软管置于过滤后的细胞上清中，直至上清全部流过His纯化柱。
   4. AKTA蛋白纯化仪准备：将A/B泵头放入已抽滤的去离子水中，清洗泵头及管路，将A泵放入A液中，B泵放入B液中。用B液冲洗管路，使B泵中充满咪唑；用A液冲洗管路，使A泵及管路中充满PBS。
   5. 设置文件保存路径及文件名，设置报警压为0.3 MPa，流速为2 mL/min，将His纯化柱连接到AKTA蛋白纯化仪上，用4倍柱体积的A液洗脱以去除未结合的杂蛋白。
   6. 2% B液洗脱非特异性结合的杂蛋白，10% B液洗脱目的蛋白，30% 及100% B液洗脱柱上残留蛋白，每个梯度洗脱4倍柱体积，收集液经SDS-PAGE电泳检测。
   （3）去除咪唑：
   1. 将经过His柱纯化的目的蛋白加入超滤管中，1,800× g，4 ℃离心30–45 min，可多次离心，直至浓缩到1 mL。
   2. 由于咪唑会影响蛋白稳定性，因此需用缓冲液将蛋白中的咪唑进行置换。加入PBS至10 mL，1,800× g，4 ℃离心30–45min，可多次离心，直至蛋白浓缩到1 mL，以上过程重复三次，最后一次浓缩至4 mL。
   （4）分子筛纯化：
   1. 样前准备：测定蛋白浓度，计算蛋白量，选择合适的分子筛进行纯化。若蛋白量小于10 mg，选用 Superdex™ increase 10/300 200 GL(S200)，若蛋白量大于10 mg，选用Hiload™ 16/600 Superdex™ 200 PG(B200)，若蛋白大于40 mg，则将蛋白分为几份多次上样，以下我们以B200为例进行介绍。
      b.分子筛柱的连接和平衡：将A/B泵头放入已抽滤的去离子水中，清洗泵及管路，清洗体积约15 mL左右。设置报警压为0.3 MPa，流速为0.5 mL/min，先将B200上方的Stop plug移除，由于下方Transport device压力，上方螺纹接口处会有液体渗出，通过液液相接将柱子的上方连入AKTA纯化仪，立刻将下方Transport device去除以免压力过高损害柱子，将分子筛柱连入仪器。先用0.5倍柱体积去离子水（60 mL）清洗，暂停机器，将泵头放入已抽滤的PBS中，提高流速至1 mL/min，约1倍柱体积（120 mL）平衡，直到电导平稳后终止程序。平衡分子筛纯化柱需要约4 h，因此需提前准备以免耽误实验。
   2. 仪器准备：上样前选择保存路径并保存文件（命名注意准确标明日期，蛋白名称，所用buffer及纯化柱型号）。将5 mL 进样环连接在仪器上，取5 mL注射器吸取PBS缓冲液，从进样口注射3倍体积缓冲液清洗进样环。
   3. 上样：将3.16浓缩得到的蛋白样品，10,000× g，4 ℃ 离心10 min，重复离心两次后小心取上清上样。上样体积4 mL左右。设置报警压为0.3 MPa，流速1 mL/min，用注射器将样品小心打入样品环中，避免产生气泡。调整UV归零，点击injection上样。点击peak fractionation，设置收集体积为1.5 mL 。观测UV 280信号，大于5mAU时收集蛋白。
   4. SDA-PAGE电泳检测蛋白大小及纯度：将上述收集的每管蛋白分别取20 μL于两个新的1.5 mL EP管中，加入5 μL 5× loading buffer及 5× loading buffer（+DTT），100 ℃水浴加热10 min。样品快速离心以确保加热时蒸发到管壁的水分离心至管底，保证每管样品体积一致。12% SDS-PAGE电泳凝胶，每孔上样15 μL，并加入彩色预染marker，180 V恒压电泳约一小时，溴酚蓝跑至胶板底部且蛋白所在处marker完全分开时，结束电泳。 打开胶板，切除顶部浓缩胶及底部溴酚蓝蓝色部分，将胶置于考马斯亮蓝染液中，微波加热1 min后于摇床上染色10 min，弃染液并用自来水清洗，加入脱色液后微波加热1 min，再于摇床上脱色，直至背景蓝色退去并出现清晰的蛋白条带。
   （5）浓度测定：
   纯化后的目的蛋白用超滤管浓缩，用Nanodrop2000 吸光度 280法测定蛋白浓度，选择默认的设定Type为1 Abs＝1 mg/mL。检测时先抬起检测臂，用去离子水清洗基座，擦干净后加入2 μL 缓冲液，点击blank调零，擦去缓冲液，在基座上加2 μL 样品，点击measure进行检测。检测结束用干净的纸巾擦拭上下基座。

二、Biacore 8K仪器准备

1. 将buffer tube放入1L PBST缓冲液中。
2. 打开BiacoreTM 8K Control Software 控制软件，设置样品舱和检测舱温度，一般设为室温25 ℃。
3. 在Instrument control界面点击change chip，待芯片舱门打开，取出维护芯片，更换Protein A芯片，关上舱门，选择芯片类型Protein A，dock chip。
4. 点击change solutions，系统更换PBST缓冲液。

三、细胞上清中抗体浓度测定及捕获条件的摸索

1. 在控制软件界面点击methods，选New新建方法，选择Concentration→Serial concentration。
2. 按照预设程序引导填写相关内容：Regeneration Solution为 10 mM Gly-HCl pH 1.5，在Calibration界面设定标准曲线的浓度梯度，Samples界面根据待测样品数量增加或减少循环次数，control sample界面填写control样品浓度。
3. 在3.Cycle overview界面，查看程序运行顺序。在4.Plate layout界面，查看样品板以及样品位置和样品体积 。
4. 细胞上清液用0.22 μm微孔滤膜过滤，10,000× g离心3–5min，小心取上清，按照程序设定的位置和体积加入样品，并放入对应的样品架上。
5. 在Instrument control界面右下方点击hotel door打开样品舱门，将样品架放入对应位置，关闭舱门。
6. 点击Send to queue，再次检查样品板放置位置，确认无误后点击Ready to Start，选择保存路径，点击Save，程序开始运行。

四、样品制备以及亲和力检测

1. 细胞上清用0.22 μm微孔滤器过滤，根据抗体浓度和捕获条件摸索结果进行稀释。抗体与RBD分子量比为5:1，设定理论Rmax为200RU，根据公式RL = （Rmax*Ligand MW）/（Analyte MW *Sm）（RL为偶联水平，Rmax为分析物最大结合量，Sm为化学计量比，本实验为1）计算的抗体偶联量应该在1000 RU，据抗体浓度测定及捕获水平，本实验抗体浓度选择3 μg/mL，进样时间2 min，捕获量为1000 RU左右。
2. 纯化的RBD用缓冲液PBST从400 nM开始进行倍比稀释，设置5个梯度，依次为400 nM、200 nM、100 nM、50 nM及25 nM。10,000× g离心5 min，小心吸取上清，加样时避免产生气泡。
3. 实验程序设置：
   1. 在控制软件control software界面点击methods，选New新建方法，选择Antibody/general→Kinetics/affinity→Single-cycle kinetics using capture。
   2. 根据程序引导填写相关信息：在1.Method definition界面，capture时间根据捕获条件设定；Single cycle kinetics界面中勾选Solution，Concentrations per cycle选择“5”，Regeneration solution为10 mM Gly-HCl pH1.5；在Variables and positioning 界面填写样品名称及浓度信息， 可根据样品数量选择增减cycle。
   3. 在Cycle overview界面检查整个实验流程，如有问题可返回修改。
   4. 严格按照Plate layout界面显示，在96孔板上加样，注意加样体积应比layout界面显示体积略多一点，以免由于液体蒸发等原因进气。加样前样品10,000× g高速离心3–5 min，去沉淀除气泡，小心加样，避免产生气泡。
   5. 点击Instrument control界面底部hotel door打开样品舱门，将加好样的96孔板按正确方向放在样品架上，按照程序显示放入相应位置，关闭样品舱门。
   6. 点击Send to queue，再次检查样品及样品板位置等信息，确认无误后， 点击ready to start，选择文件保存路径，点击Save，程序开始运行。
   7. 实验结束，将buffer tube从缓冲液中取出用纯水冲洗外表面，无尘纸擦干后放入装有纯水的试剂瓶中
   8. 点击change chip，芯片舱门打开，取出Protein A芯片，换上维护芯片，关上舱门，选择芯片类型为maintenance chip，点击change solution。
   
   

五、数据分析与数据解析

1. 打开分析软件“Biacore^TM Insight Evaluation Software”。
2. 在Create new evaluation界面1.Select runs中选择待分析的文件。
3. 浓度分析：在2.Select evaluation method界面选择分析模型Predefined→Concentration→Serial concentration-Evaluation method，软件自动分析浓度测试结果。
4. 亲和力分析：在2.Select evaluation method界面选择分析模型Predefined→Kinetics/affinity→Antibody/general→Single-cycle kinetics using capture—Evaluation method，软件自动拟合得到亲和力分析结果。
5. 数据导出：在home界面，选择合适的输出文件格式和保存路径。

实验注意要点

1. Biacore 8K的缓冲液需新鲜配置，用0.22 μm滤膜过滤除杂质，高压灭菌后使用。
2. 细胞上清成分复杂，杂质较多，因此样品制备时一定要用0.22 μm微孔滤膜过滤，且上样前一定高速离心去除沉淀，否则不仅容易堵塞仪器的微流路，而且清洗不及时很容易滋生细菌，影响后续实验。实验结束后，应及时运行Desorb程序清洗微流路，并定期运行Desorb and Sanitize清洗仪器。
3. 由于His柱纯化洗脱下来的蛋白溶液含有较高浓度的咪唑，容易造成分子筛纯化柱堵塞，因此在分子筛纯化前需将亲和纯化的蛋白样品中的咪唑去除。本实验选择用10 KDa的超滤管换液。如果蛋白容易沉淀或聚集，可选择其他方式换液，如脱盐柱、透析等方法。
4. 应尽量使用新鲜制备的蛋白样品，切勿4 ℃存放太久，长时间不用，应分装成小份经液氮速冻后存于-80 ℃冰箱保存，避免反复冻融造成蛋白活性降低。
   

结果与数据分析

1. 抗原RBD表达纯化结果
   分析物新冠病毒S蛋白的受体结合结构域（RBD）首先用His柱亲和纯化，经2%B液洗脱杂蛋白后，收集10% B液洗脱的目的蛋白，经浓缩后进行分子筛纯化。从纯化的结果来看，虽然亲和纯化中10% B液洗脱下来是一条比较纯的条带（图1A），但是其中仍然有部分为聚体形式（图1B）。聚体的存在可能会影响相互作用实验的结果，因此在检测亲和力之前，样品经亲和纯化后一定要用分子筛进一步纯化，选择均一性好的活性分子作为分析物。
2. 细胞上清中抗体浓度测定及捕获条件的摸索
   因不同的重组抗体在细胞中的表达量有所不同，为避免不同抗体的捕获量差异太大对亲和力测定的影响，因此正式筛选实验前我们利用Biacore 8K软件中的浓度分析模块，用Protein A芯片直接从细胞上清中捕获抗体，测定重组抗体的浓度，同时根据结合信号判断亲和力筛选实验中抗体捕获的浓度以及捕获时间。
   浓度测定结果如图2所示，部分抗体表达水平较高，因此需对细胞上清原液进行适当稀释，确定最终的实验条件为：抗体浓度3 μg/mL，进样时间2 min，最终的捕获量控制在800–1,000 RU范围内。如果抗体表达量较低，可以适当延长进样时间或者对细胞上清进行适量浓缩。
3. 细胞上清中高亲和力抗体的筛选
   本实验一次性筛选了34个重组抗体，其中4个抗体与抗原失去结合能力，其它抗体的亲和力均在10-9–10-8M水平，部分实验结果如图3所示，后续可挑选亲和力最高的几个抗体进行进一步研究。
4. 小结
   该方法已用于大量的抗体筛选工作，例如2022年Immunity发表的文章“Atlas of currently available human neutralizing antibodies against SARS-CoV-2 and escape by Omicron sub-variants BA.1/BA.1.1/BA.2/BA.3”[1]，通过此方法分析了50种人单克隆抗体对奥密克戎亚突变株BA.1、BA.1.1、BA.2和BA.3的亲和力，发现大多数抗体对奥密克戎失去了结合能力。同时检测了RBD-5 单克隆抗体与BA.2 RBD以及G446S突变的亲和力，并证明G446S突变能够削弱RBD-5单克隆抗体的作用，结合抗原抗体复合物结构解析，阐明了奥密克戎突变株免疫逃逸的分子机理，为新冠病毒广谱治疗性抗体和疫苗的研发提供了指导。
   综上所述，利用表面等离子共振分子相互作用分析仪Biacore 8K，可以从细胞培养上清中快速测定重组抗体浓度以及亲和力参数，可以大大减轻工作量，缩短检测时间，节省检测成本，为重组抗体的研发提供了简单高效的实验方法。
   
   
   图1.分析物RBD经His柱及分子筛纯化及SDS-PAGE电泳检测结果
   
   
   图2. 细胞上清中重组抗体浓度测定结果
   
   
   图3. 重组抗体筛选的部分结果
   

致谢

感谢苏朝、胡钰及刘川玉在本实验过程中给予的大力支持！

参考文献

1. Huang, M., Wu, L., Zheng, A., Xie, Y., He, Q., Rong, X., Han, P., Du, P., Han, P., Zhang, Z., et al. (2022). Atlas of currently available human neutralizing antibodies against SARS-CoV-2 and escape by Omicron sub-variants BA.1/BA.1.1/BA.2/BA.3. Immunity 55(8): 1501–1514.e3.