新冠病毒RBD和特异性纳米抗体的亲和力测定方法
The Affinity Assay for SARS-CoV-2 RBD and the Specific Nanobodies   

引言

在新冠疫情中，中和抗体作为被动免疫治疗的手段之一已被广泛研究，抗体对抗原的亲和力是其有效性的关键因素，因此研究抗体与抗原的亲和力具有重要意义。检测抗体与抗原亲和力的方法有多种，例如表面等离子共振技术（SPR）、酶联免疫吸附测定（ELISA）和生物层析技术等。尽管这些方法都有其用途，但SPR技术在检测抗体与抗原亲和力方面具有独特的优势。SPR技术通过监测生物分子在金属表面上的相互作用引起的表面等离子共振现象，实时监测它们的结合与解离过程，从而得到抗原与抗体的亲和力和动力学参数。这对于理解抗体-抗原相互作用的复杂性非常重要，可以为设计更有效的治疗药物提供关键信息。因此，SPR技术在抗原抗体亲和力测定中被广泛应用，并被认为是一种高度准确的方法。
SARS-CoV-2新冠病毒表面具有糖基化的刺突蛋白(spike protein, S)，位于S蛋白上的受体结合区域（RBD）能与宿主细胞受体蛋白ACE2相互作用并触发膜融合，因此阻断RBD与ACE2的结合是治疗新冠病毒感染的有效途径。靶向RBD区域的中和抗体可通过阻断RBD与受体ACE2的结合起到抗病毒作用。
纳米抗体(nanobody)，又称单域抗体 (single-domain antibody, VHHs)，是来自骆驼科动物重链抗体的单域可变区 (single-domain variable regions)。纳米抗体通常可以获得与常规抗体相当的抗原亲和力特性，同时又具有分子量小(~15 kDa)、免疫原性低、更好的溶解度和稳定性、较长的CDR3区等优点，多株靶向RBD的纳米抗体已被分离和鉴定，并表现出良好的体内外抗病毒活性。
在我们的前期研究中报道了两株纳米抗体R14和S43[1]。在亲和力测试过程中，通过不同标签来标记蛋白进行固定时，获得的亲和力数据差异较大。我们期望通过这项研究，深入了解不同标签构建的抗原和抗体之间的亲和力差异及造成该现象的原因，为抗体药物的设计提供可靠的亲和力检测方法。

材料与试剂

1. pCAGGS载体（MiaoLingPlasmid，catalog number: P0165）
2. DMEM培养基（Invitrogen，catalog number: C11995500BT）
3. FBS（ANALYSIS QUIZ，catalog number: AQmv02200）
4. SMM 293-TII Expression Medium（SinoBiological，catalog number: M293TII-1L）
5. Sinofection Transfection Reagent（SinoBiological，catalog number: STF02-5ML）
6. SMS 293-SUPI cell culture supplement（SinoBiological，catalog number: M293-SUPI-100 mL）
7. HEK293F细胞（Gibco，catalog number: 11625-019）
8. HEK293T细胞（ATCC，catalog number: CRL-3216）
9. Polyethylenimine（PEI）（Yeasen，catalog number: 40816ES03）
10. HisTrap HP 5 mL column（Cytiva，catalog number: 17524802）
11. HiLoad 16/600 Superdex 200 pg（Cytiva，catalog number: 28989335）
12. NHS-PEG12-Biotin生物素（Thermo Scientific，catalog number: 21312）
13. 超滤管15 mL 10KD（Merck millipore，catalog number: UFC901096）
14. 超滤管15 mL 30KD（Merck millipore，catalog number: UFC903096）
15. Series S Sensor Chip SA（Cytiva，catalog number: 29104992）
16. Series S Sensor Chip Protein A（Cytiva，catalog number: 29127556）
17. BCA蛋白浓度测定试剂盒（Beyotime，catalog number: P0010）
18. 含有20% FBS的DMEM培养基（见溶液配方）
19. 10× PBS储备液（见溶液配方）
20. 1× PBS工作液（见溶液配方）
21. PBST（0.05% Tween-20）（见溶液配方）

仪器设备

1. 低温离心机（Oxford Lab Products，model: OD-16R）
2. 超速离心机（Himac，model: CR22N）
3. 二氧化碳恒温摇床（精骐，model: IS-9CT）
4. 二氧化碳培养箱（Thermo，model: 371）
5. 显微镜（OLYMPUS，model: CKX31）
6. 生物安全柜（哈东联，model: Ⅱ级A2）
7. 蛋白纯化系统（GE Healthcare，model: ÄKTATM pure）
8. 微量分光光度计（奥盛，model: Nano-300）
9. 电泳仪（君意，model: JY300HE）
10. 脱色摇床（欧诺，model: HNY-903H）
11. 酶标仪（TECAN，model: INFINITE M200 PRO）
12. 分子相互作用分析仪（GE Healthcare，model: Biacore 8K）
    

实验步骤

一、样品制备

1. 生物素化抗原蛋白测定亲和力
   1.1.1抗原RBD的表达和纯化
   1. 将SASR-CoV-2 BA.1 RBD（319-541）的N端依次连接Kozak序列（gccacc）和信号肽IL-10序列、C端依次连接6个组氨酸和终止密码子TAG，通过EcoR I和Xho I限制性酶切位点克隆构建进pCAGGS载体。
   2. 于37 ℃，5% CO₂ 的条件下培养HEK293F细胞，使细胞密度约为3 × 10⁶ cells/mL，使用Sinofection转染试剂与表达质粒配制成转染液，滴加到细胞培养液中，转染20-24h后加入SMS 293-SUPI培养基加料液，继续培养5天左右。收集表达液，8,000 × g离心1小时，取上清，使用HisTrap HP 5 mL column捕获目的蛋白，使用1 M的咪唑分级梯度法洗脱目的蛋白质，并使用超滤管浓缩后，使用HiLoad 16/600 Superdex 200 pg凝胶柱进一步纯化[2]，最后通过SDS-PAGE和Western blot鉴定表达的抗原RBD蛋白。
   1.1.2抗原RBD的生物素标记
   1. 使用Nano-300对拟偶联生物素的蛋白进行定量。
   2. 计算生物素化试剂使用量：所需10 mM生物素化试剂的体积（μL）= （蛋白浓度（μg/μL）/ 蛋白分子量（kDa））× MCR × 蛋白体积（μL）× 0.1 (MCR：生物素与蛋白的摩尔比)。 例如：生物素化100 μL浓度为1 mg/mL的RBD蛋白(30kDa），MCR=1:1，所需10 mM生物素化试剂体积为0.3 μL。
   3. 将所需用量的蛋白质与生物素试剂混合均匀，4 ℃孵育，1小时后转移至10 KD的超滤管，并加入15 mL 1× PBS，于4 ℃，2,800 × g离心，直至蛋白液浓缩至500 μL左右，再次加入15 mL 1× PBS，相同条件下继续离心，直至蛋白液浓缩至500 μL左右。离心重复三次以上，通过该方式去除多余的生物素。将蛋白液转移至一干净的EP管，对偶联有生物素的蛋白进行定量。
2. 生物素化纳米抗体测定亲和力
   2.1.1带有组氨酸标签的纳米抗体的表达和纯化
   1. 将纳米抗体R14和S43序列的N端依次连接Kozak序列（gccacc）和信号肽IL-10的序列、C端依次连接6个组氨酸和终止密码子TAG，通过EcoR I和Xho I限制性酶切位点克隆构建进pCAGGS载体。
   2. HEK293F细胞表达纳米抗体及蛋白纯化过程详见1.1.1步骤。
   2.1.2纳米抗体的生物素标记
   纳米抗体生物素标记过程详见1.1.2。
3. 将纳米抗体的C端连接人IgG1 Fc标签的方法测定亲和力
   1. 将纳米抗体R14和S43序列的N端依次连接Kozak序列（gccacc）和信号肽IL-10序列、C端依次连接人IgG1 Fc的序列和终止密码子TAG，构建进pCAGGS载体。
   2. 使用含有20% FBS的DMEM培养基，第一天培养HEK293T细胞，第二天细胞汇合密度至80%左右。事先将细胞培养皿中的培养基换成不含血清的DMEM培养基，重组质粒与PEI按1：3比例混匀并进行转染，4-6 h后更换为不含FBS的DMEM培养基，37 ℃培养。48 h后收集表达液，在8,000 × g，4 ℃，离心20min，取上清。重复离心的步骤，取上清，置于冰上保存。
      
      

二、样品测定
1.使用SA芯片测定亲和力
1.1.1生物素化蛋白的偶联

1. 使用PBST为系统缓冲液，S系列SA芯片，生物素化蛋白浓度10 μg/mL。
2. 打开Biacore^TM 8K Control Software控制软件，更换SA芯片，新建methods，选择New→Empty methods→Empty Immobilization method → 选择SA-biotin capture→选择样品通道，填写样品名称以及进样时间，按照Positioning and plate layout界面显示的体积和位置加样（图1.）。
3. 将样品板放入样品舱，点击Send to queue，检查样品及样品板放置位置，确认无误后点击Ready to start，保存文件，程序开始运行。
   
   
   图1. 生物素化蛋白固定程序
   
   

1. 使用PBST为系统缓冲液，S系列Protein A芯片，蛋白浓度10 μg/mL。
2. 新建Methods，选择Antibody/general→Kinetics/affinity→Single-cycle kinetics using capture，按照引导设置程序，Regeneration Solution为10 mM Gly-HCl pH1.5，RBD的浓度梯度为6.25 nM、12.5 nM、25 nM、50 nM、100 nM。
3. 按照plate layout显示小心将样品加入96孔板，避免产生气泡。
4. 将样品板放入样品舱，点击Send to queue，检查样品及样品板放置位置，确认无误后点击Ready to start，保存文件，程序开始运行。（图3）
   
   
   
   图3. ProteinA芯片捕获法亲和力测定实验程序
   
   
   
   视频1. 新冠病毒RBD和特异性纳米抗体的亲和力测定方法

三、数据分析

1. 实验数据用Biacore^TM Insight Evaluation Software进行分析。在Biacore^TM 8K Control Software中打开待分析文件，在Run proterties界面点击Open in Evaluation Software，链接到分析软件，在Predefined中选择待分析文件类型，软件自动拟合得到分析结果。（图4）
2. 数据导出：点击Home界面，选择合适的格式导出实验结果。（图5）
   
   
   图4. 数据分析步骤
   
   
   图5.数据导出

实验注意要点

1. 蛋白生物素标记时要确保缓冲液中不含有其他任何带有氨基的物质（如Tris等）。
2. 生物素化样品建议现配现用，并置于冰上保存，避免反复冻融。
3. 游离的生物素需通过透析或脱盐等方法去除，残留生物素会影响生物素化蛋白的偶联。
4. 所有的样品及试剂，上样前应高速离心，弃沉淀，否则容易堵塞微流路。
5. 系统缓冲液需新鲜配置，勿用保存已久的溶液，且需用0.22 μm的微孔滤膜过滤后使用。

结果与数据分析

实验结果表明，生物素标记的纳米抗体R14和S43与RBD的亲和力分别为3.2 nM和2.5 nM（图6A），然而生物素化抗原RBD检测纳米抗体时，测得的亲和力则分别为4116.7 nM和276.8 nM（图6B）。为了获取更真实的亲和力数据，我们利用Protein A芯片捕获带有人IgG1 Fc标记的R14（DR14）和S43（DS43），将RBD作为流动相来检测其亲和力，结果表明，DR14和DS43与RBD之间的亲和力分别为5.3 nM和0.8 nM（图6C），与通过SA芯片捕获生物素化的纳米抗体得到的亲和力相当。
前期工作中我们对BA.1 RBD和纳米抗体R14和S43的晶体结构进行了解析[1]，通过分析互作表位发现RBD中与R14结合的27个残基中的6个带有氨基（-NH₂），与S43结合的23个残基中的3个带有氨基（-NH₂），可能由于这些部位的氨基被生物素随机结合，占据了RBD的抗体结合位点或改变了RBD的结合构象，从而影响了与纳米抗体R14和S43的结合。因此，抗原RBD偶联生物素后与抗体的亲和力降低，造成实验数据偏离实际亲和力。
综上所述，利用表面等离子共振技术测定亲和力时，配体的标记方法和固定方式可能造成配体的结合位点的修饰或封闭，从而影响亲和力数据，因此选择合适的蛋白质标记方法和固定方式至关重要。


图6. 不同方法测定的抗原和抗体之间的亲和力比较。（A）使用SA芯片固定生物素化纳米抗体R14和S43检测RBD获得的亲和力结果。（B）使用SA芯片固定生物素化抗原RBD检测抗体R14和S43获得的亲和力结果。（C）将纳米抗体R14和S43的C端连接人IgG1 Fc并使用protein A芯片捕获抗体，检测抗原RBD获得的亲和力结果。拟合曲线及亲和力参数均由软件BiacoreTM Insight Evaluation Software分析获得。ka（M-1s-1）: 结合速率常数；kd（s-1）:解离速率常数；KD（nM）:平衡解离常数，KD=kd/ka。（−为拟合曲线， 为实测曲线）

溶液配方

1. 含有20% FBS的DMEM培养基
   将FBS置于56 ℃水浴中热处理30分钟后，取其中20 mL加入至80 mL DMEM培养基，待用。
2. 10× PBS储备液
   NaCl 80 g，KCl 2 g，Na₂HPO₄·12H₂O 35.8 g，KH₂PO₄ 2.4 g，使用双蒸水定容到1 L，常温保存备用。
3. 1× PBS工作液
   将100 mL的10×PBS储备液使用双蒸水定容到1 L，并使用0.22 μm微孔滤膜过滤，现配现用。
4. PBST（0.05% Tween-20）
   量取1 L 1× PBS，加入0.5 mL Tween-20，并使用0.22 μm微孔滤膜过滤，现配现用
   

致谢

本研究得到了国家自然科学基金重点项目（81830050）和中国科学院战略性先导科技专项（XDB29040203）的支持。

参考文献

1. Liu, H., Wu, L., Liu, B., Xu, K., Lei, W., Deng, J., Rong, X., Du, P., Wang, L., Wang, D., et al. (2023). Two pan-SARS-CoV-2 nanobodies and their multivalent derivatives effectively prevent Omicron infections in mice. Cell Rep. Med. 4(2): 100918. doi: 10.1016/j.xcrm.2023.100918
2. 李昕，贺娟华，樊峥. (2023). 利用 Biacore 8K 从哺乳动物细胞上清中快速筛选高亲和力抗体. Bio-101 e1011003. Doi: 10.21769/BioProtoc.1011003.