剪接因子SRSF7和mRNA的相互作用测试
The Interaction Detection between Serine/arginine-rich Splicing Factor 7 and mRNA   

研究背景

目前有很多方法可以用来研究RNA与蛋白之间的相互作用，包括电泳迁移率测定、RNA pull down、RNA足迹、RNA免疫沉淀、紫外线诱导交联免疫沉淀等[3]。这些方法虽然在很多方面能够解决RNA与蛋白之间的相互作用分析问题，但都存在步骤繁琐、耗时费力、检测弱相互作用能力弱、信息量偏少等缺点。为了验证ssRNA-m6A和SRSF7之间的直接结合，我们利用表面等离子体共振（SPR）技术分析它们之间的相互作用。SPR检测技术具有实时检测、高效快速、亲和力测试动态范围宽等特点，可以获得RNA与蛋白之间亲和力常数等全面的互作信息。
Biacore是基于SPR技术来实时跟踪记录生物分子间相互作用的表面等离子共振仪。SPR检测原理是光在棱镜与金属膜表面发生全反射现象时会形成消逝波进入金属介质，而在金属介质内存在表面等离子波，当消逝波与表面等离子波的传播常数相匹配时，引起金属膜内自由电子产生共振，即表面等离子体共振。发生SPR时，入射光能量被表面等离子体吸收，使反射光的能量急剧减少甚至接近为0。这种最小化发生时的入射光角度称为 SPR 角。分子间的结合/解离造成金膜附近折光率的实时变化，导致SPR角的变化，这一现象被Biacore实时记录。
Biacore检测RNA与蛋白之间相互作用的原理为生物素标记的ssRNA-m6A和ssRNA可以偶联在含有链霉亲和素的SA芯片上，偶联在芯片上的分子称为配体分子。链霉亲和素-生物素是自然界中最强的非共价相互作用之一，生物素标记的配体分子可以稳定的结合在SA芯片上而不被洗脱。当分析蛋白分别流过偶联了ssRNA-m6A和ssRNA芯片时，若蛋白与ssRNA-m6A或ssRNA有相互作用，则蛋白结合在芯片上，导致SPR角的变化，仪器产生上升的响应信号。当分析蛋白停止流过芯片时，由于蛋白与RNA形成自发解离，仪器产生下降的响应信号。因此Biacore可以获取RNA与蛋白反应过程中它们相互作用的特异信号，从而实现相互作用的实时动态检测。
本文描述的方法适用于所有生物素标记的RNA与蛋白之间的相互作用研究，经过简单优化也适用于DNA与蛋白之间的相互作用研究。比如在DNA与蛋白的相互作用测试时，缓冲液和样品都不需要添加RNase Inhibitor，溶液配制不需要DEPC 水，只需超纯水。总之，Biacore 8K具有高通量、高灵敏度、实时监测等特点，特别适合核酸与蛋白的相互作用检测。

材料与试剂

1. 重组SRSF7蛋白（上海交通大学系统院陶生策课题组制备）
2. S系列SA芯片 (Cytiva, Series S Sensor Chip SA, 产品目录号: BR100531)
3. ssRNA: Biotin-5'-CGUCUCGGACUCGGACUGCU-3'；
4. ssRNA-m6A: Biotin-5'-CGUCUCGG(m6A)CUCGG(m6A)CU-3'（金斯瑞公司合成，南京, 中国)
5. 96孔板 (Cytiva, 产品目录号: BR100503)
6. 96孔板封膜 (Cytiva，产品目录号: 28975816)
7. 10× HBS-P缓冲液 (Cytiva，产品目录号: BR100671)
8. 50 mM NaOH溶液 (Cytiva，产品目录号: BR100358)
9. 1.5 mL EP管 (Axygen，产品目录号: BCT-150-C)
10. NaOH固体（Cytiva，产品目录号：306576）
11. NaCl 固体（Sigma，产品目录号：S7653）
12. 异丙醇（CNW，产品目录号：CAEQ-4-013493-4000）
13. RNase Inhibitor（翌圣, 产品目录号：10701ES10)
14. DEPC水（Sigma，产品目录号：693520）
15. 1.0× HBS-P缓冲液 (见溶液配方)
16. 配体分子母液 (见溶液配方)
17. SRSF7蛋白母液 (见溶液配方)
18. 5 M NaCl (见溶液配方)
19. 1 M NaOH 溶液 (见溶液配方)
    

仪器设备

1. 纯水仪 (密理博，Milli Q)
2. 表面等离子共振仪 (Cytiva，Biacore 8K)
3. 台式离心机 (赛默飞，Micro21R)
   

实验步骤

一、实验准备

打开Biacore 8K仪器和控制软件Biacore 8K Control Software（版本号4.0.8.20368），输入软件登录密码。流动池和样品舱的温度均设置为25 ℃。
用DEPC水稀释10× HBS-P缓冲液，制备1.0× HBS-P缓冲液。
将仪器右侧标记Buffer A的管路插入1.0× PBS缓冲液试剂瓶里，将标记Buffer BCD、Water和Reagent的管路插入超纯水的试剂瓶。
在Biacore 8K Control Software的System setup模块，点击Change chip，点击右侧undock chip，芯片舱打开，拿出维护芯片，按照芯片盒箭头指示方向放入新的SA芯片，关闭芯片舱。在仪器控制软件右侧选择New chip，填写芯片相关信息，然后点击Dock chip。
在Biacore 8K Control Software的System setup模块，点击Change solutions，选择Buffer position A，其余默认设置，点击Ready to start。缓冲液会以较高的流速冲洗仪器整个内部流路系统，整个过程耗时6分钟。

二、配体偶联

（1）计算配体偶联量
根据以下公式计算配体目标偶联量：


其中，Rmax为芯片表面最大结合容量，通常设为100 RU；analyte MW为SRSF7蛋白分子量，ligand MW为ssRNA或ssRNA-m6A分子量；Sm为化学计量比，通常设成1；R_L为配体偶联水平，配体目标偶联量通常为1.5倍的RL。在本研究案例中，SRSF7 分子量为27.4kDa，ssRNA和ssRNA-m6A分子量约6.7 kDa。经公式计算，SRSF7目标偶联量为40 RU。由于ssRNA和ssRNA-m6A容易降解，提高目标偶联量为60-100RU。
（2）配体偶联过程
将ssRNA或ssRNA-m6A粉末用DEPC水溶成200nM母液，并加入1 µL RNase Inhibitor。用DEPC水稀释10× PBS缓冲液，制备1.0× PBS缓冲液。使用1.0× PBS缓冲液稀释ssRNA或ssRNA-m6A母液制备5nM的配体分子。
在Biacore 8K Control Software里，选择Method，点击 New，选择Empty methods，打开Empty immobilization method方法。方法里包含四个步骤。第一步Method definition，设置Chip type为SA，点击add step，选择默认的Immobilization in Fc2 activate/deactivate in 1，选择SA-biotin capture，点击Enter custom mode。设置NaCl/NaOH的Contact time为60 s；设置Ligand的Contact time为420 s，Channel选择1-2，输入ligand name分别为ssRNA和ssRNA-m6A。第二步 Positioning and plate layout，显示了96孔板里样品放置位置和需要体积，按照要求将样品加到96孔板里。Volume的体积必须≥系统显示体积。
在Biacore 8K Control Software的Instrument control界面，Hotel door处点击open，把样品架从样品舱里取出来，把加好样品的96孔板放置到样品架上，然后放到仪器里面，把样品舱的门关闭。
点击第二步 Positioning and Plate layout后面的Send to queue，查看样本板位置是否放置正确，在Buffer positon 处点击Bottle A，查看系统要求的溶液体积是否满足需求，点击Ready to start和Save，方法开始运行。
运行结束后，结果显示ssRNA或ssRNA-m6A偶联了约 80 RU。

三、ssRNA或ssRNA-m6A与SRSF7的亲和力和动力学测试

（1）结合测试
接下来，研究者使用Biacore 8K对ssRNA或ssRNA-m6A与SRSF7 蛋白的结合能力进行了检测，目的是初步确定ssRNA或ssRNA-m6A与SRSF7 是否存在相互作用；若存在相互作用，确定进行动力学和亲和力测试时分析物的浓度范围，以及再生试剂和条件。
将仪器右侧标记Buffer B的管路插入1.0×HBS-P缓冲液试剂瓶里，将标记Buffer CD、Water和Reagent的管路插入超纯水的试剂瓶。
在Biacore 8K Control Software的System setup模块，点击Change solutions，默认设置，点击Ready to start。
在Biacore 8K Control Software，点击New method，选择Kinetics/affinity，在Antibody/general里选择 Kinetics/affinity，打开 Multi-cycle kinetics/affinity方法。第一步Method definition，将Concentration unit改成nM，Running Buffer设置为HBS-P，去除Startup步骤。在Analysis里，Analyte的Contact time设置成120 s，Dissociation time设置成120 s, 流速30 μL/min。Regeneration的 solution 设置为Glycine 2.5，contact time设置为30 s，流速30 ul/min。第二步Variables and positioning，在Analysis里，编辑 cycle数为5个，将Analyte Solution改为抗体蛋白名称，浓度分别设置成0、0、0、500、500 nM。第三步Cycle overview不需要做任何改动。第四步Plate layout，将样品配好加到96孔板里，其中0浓度和HBS-P为1× HBS-P缓冲液。96孔板放到仪器里，点击 Send to queue，点击Ready to start和Save，方法开始运行。
运行结束后，结果表明（1）ssRNA或ssRNA-m6A和500nM SRSF7蛋白互作时的结合响应满足测试需求，因此用500nM SRSF7蛋白2倍梯度稀释，共9个浓度点。（2）Glycine 2.5能够将系统再生完全，且对配体分子活性影响较小，因此选择Glycine 2.5做为再生试剂，再生时间30 s，流速30 μL/min。
（2）动力学/亲和力测试
接下来，使用Biacore 8K对ssRNA或ssRNA-m6A和SRSF7的亲和力和动力学进行检测。
用DEPC水稀释10× HBS-P缓冲液，制备1.0× HBS-P缓冲液。
分别使用1× HBS-P溶液稀释SRSF7至500 nM，再用1× HBS-P溶液配制蛋白浓度梯度，2倍稀释，共9个浓度点。
在Biacore 8K Control Software，点击New method，选择Kinetics/affinity，在Antibody/general里选择 Kinetics/affinity，打开 Multi-cycle kinetics/affinity方法。第一步Method definition，将Concentration unit改成nM，Running Buffer设置为HBS-P。在Analysis里，Analyte的Contact time设置成400 s，Dissociation time设置成600 s。将Startup里的Analyte设置成和Analysis里完全一样的实验条件。第二步Variables and positioning，在Analysis里，Add cycle至13个循环，将Analyte Solution改为分析物名称SRSF7，SRSF7浓度分别设置成0、0、1.95、3.9、7.8、15.6、31.25、31.25、62.5、125、250、500、0 nM；在Startup里，Add cycle至5个循环。第三步Cycle overview不需要做任何改动。第四步Plate layout，将样品配好加到96孔板里，其中0浓度和HBS-P为1× HBS-P缓冲液。96孔板放到仪器里，点击 Send to queue，点击Ready to start和Save，方法开始运行。
使用Biacore 8K仪器一次可以做8个配体分子的动力学测试。在本实验案例中，由于Channel 1-2分别固定ssRNA或ssRNA-m6A蛋白，2个配体分子和1个SRSF7蛋白分子只需要使用Biacore 8K仪器做一轮实验。

实验注意要点

1. 配体偶联：
   对于蛋白和小分子相互作用实验，配体蛋白偶联量约10000 RU即可开展实验。如果不确定配体蛋白的实际偶联效果，可以在Immobilization方法里先去掉封闭Ethanolamine这步，等蛋白偶联量达到预期后，再使用Immobilization方法单独运行Ethanolamine这步。
2. 小分子药物溶液配制：
   很多小分子药物溶解性不好，需要DMSO助溶。小分子药物配成最高实验浓度后，需要离心观察是否有沉淀，如果离心后没有看到沉淀，则取上清液做浓度梯度稀释，如果离心后看到沉淀，则需要降低小分子药物的最高实验浓度。在表面等离子共振仪实验中，小分子药物做分析物，其浓度必须是准确的，否则会影响亲和力KD的数值。
3. 小分子药物A-B-A竞争抑制实验的浓度设置：
   Solution A为小分子药物，如果小分子药物和芯片上的蛋白有一定的结合信号，小分子药物的浓度需要设置为能使芯片上蛋白位点饱和的浓度，数值通常比较高，如100 µM或200 µM，并且小分子药物的结合信号可以通过设置A-A-A作为零浓度进行扣减。
   Solution B中蛋白的浓度通常设为蛋白和蛋白亲和力KD同样数量级的浓度。
   由于很多小分子药物是快结合快解离的模式，因此Solution B中需要同样添加和Solution A中一样浓度的小分子药物。
   

结果与数据分析

（1）SRSF7与ssRNA或ssRNA-m6A的亲和力和动力学检测：
使用Biacore 8K的分析软件Biacore Insight Evaluation software对结果进行分析。在Create new evaluation界面，找到要处理的文件，点击Select evaluation method，在Predefined界面，选择Kinetics/affinity里的Antibody/general，双击 Multi-cycle kinetics-Evaluation method。仪器默认会把进样前后的部分曲线截掉，如果不想截掉，点击图右侧的小齿轮，在Remove range里，去掉勾选的Remove ranges at start and end of injections。在Settings中选择Serial，在Kinetics/Affinity mode点击Kinetics，Fit models选择1:1 binding模型，在Initial values里，Rmax选择Fit local，点击Perform fit，即得到拟合结果，包括结合速率ka，解离速率kd，Rmax和亲和力KD。
如图1，结果显示SRSF7有选择性地与ssRNA-m6A结合，其亲和力比对照组（ssRNA）高2倍，表明SRSF7蛋白是具有m6A修饰的mRNA的潜在阅读器。


图1. Biacore 8k检测SRSF7蛋白与ssRNA和ssRNA-m6A互作的亲和力和动力学传感图

溶液配方

1. 1.0× HBS-P缓冲液
   量取100 mL 10× HBS-P缓冲液，加900 mL DEPC 水，使用0.22 µm过滤器和循环水多用真空泵过滤到装缓冲液的瓶子里。
2. 配体分子母液
   将ssRNA或ssRNA-m6A用1.0× HBS-P缓冲液溶成200nM母液，加入RNase Inhibitor至终浓度为1 U/mL。
3. SRSF7蛋白母液
   纯化的SRSF7蛋白，溶于1.0× HBS缓冲液，BCA法测试蛋白浓度，加入RNase Inhibitor至终浓度为1U/mL。
4. 5 M NaCl
   量取2.9克NaCL固体粉末，加入9 mL DEPC 水溶解，定容至10 mL。
5. 1 M NaOH 溶液
   量取0.4 G NaOH固体粉末，加9 mL DEPC 水溶解，定容至10 mL。
   

致谢

感谢上海交通大学系统生物医学重点实验室（教育部）陶生策教授课题组，感谢陈红同学的帮助。

参考文献

1. Cun, Y., An, S., Zheng, H., Lan, J., Chen, W., Luo, W., Yao, C., Li, X., Huang, X., Sun, X., et al. (2021). Specific Regulation of m6A by SRSF7 Promotes the Progression of Glioblastoma. Genomics, Proteomics & Bioinformatics 21(4): 707–728. https://doi.org/10.1016/j.gpb.2021.11.001
2. Jiang, H. W., Chen, H., Zheng, Y. X., Wang, X. N., Meng, Q., Xie, J., Zhang, J., Zhang, C., Xu, Z. W., Chen, Z. Q., et al. (2023). Specific pupylation as IDEntity reporter (SPIDER) for the identification of protein-biomolecule interactions. Sci. China Life Sci. 66(8): 1869–1887. https://doi.org/10.1007/s11427-023-2316-2
3. Popova, V. V., Kurshakova, M. M. and Kopytova, D. V. (2015). Methods to study the RNA-protein interactions. Mol. Biol. 49(3): 418–426. https://doi.org/10.1134/s0026893315020107