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生物传感芯片的回收及CM芯片的重制
Recovery of Biosensor Chips and Remake of CM Chip   

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摘要:生物传感芯片是基于表面等离子共振(Surface Plasmon Resonance,SPR)的生物相互作用分析仪测试的核心部件。传感芯片为玻璃基底上镀金膜,在测试分子相互作用前,先将一种受体分子固定在金膜表面,然后使与之相互作用的配体分子流过芯片表面,SPR检测器就能实时监测配体分子与受体分子结合、解离过程。通常,供应商开发的传感芯片使用最为广泛,但是,固定蛋白或其他受体的芯片经过数次循环测试后,分子容易失去生物活性或脱落,而芯片则因不能再生而失去了继续使用的价值。考虑到生物传感芯片价格昂贵,本文尝试对废弃芯片进行回收利用,并重制用于直接偶联蛋白的具有羧甲基化葡聚糖表面(carboxymethylated dextran matrix surface,CM)的芯片,可再次用于SPR分析测试。

关键词: 生物传感芯片, 芯片回收, CM芯片重制

材料与试剂

  1. 废弃生物传感芯片(Cytiva,Cytiva,CM5、CM7、SA等芯片)
  2. 裸金芯片(Cytiva,Cytiva,SIA Kit Au:BR-1004-05)
  3. 乙醇(上海阿拉丁生化科技股份有限公司,Aladdin,AR:E111989-500mL)
  4. 浓硫酸(天津市津东天正精细化学试剂厂,津东天正,AR)
  5. 双氧水(上海阿拉丁生化科技股份有限公司,Aladdin,AR,30 wt% in H2O:H112515-500mL)
  6. 11-巯基十一醇(西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司,Sigma-Aldrich,97%)
  7. 环氧氯丙烷(上海阿拉丁生化科技股份有限公司,Aladdin,AR,99.5%)
  8. 二乙二醇二甲醚(安徽泽升科技有限公司,安耐吉化学,99.5%)
  9. 葡聚糖(上海阿拉丁生化科技股份有限公司,Aladdin,Mw = 1500、25000、60000 以及500000 g/mol,AR,99.5%)
  10. 溴乙酸(西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司,Sigma-Aldrich,97%)
  11. 透明双面胶(丰裕工业胶带,皇冠,PET透明双面胶带:7982)
  12. 牛血清蛋白(上海阿拉丁生化科技股份有限公司,Aladdin,96%)
  13. 氨基偶联试剂盒(Cytiva,Cytiva,Amine Coupling Kit:catalog number: BR100050)
  14. 醋酸钠缓冲溶液(Cytiva,Cytiva,Acetate 4.0:catalog number: BR100349)
  15. 98% H2SO4/30% H2O2(7:3)溶液(见溶液配方)
  16. 11-巯基十一醇溶液(见溶液配方)
  17. 表氯醇溶液(见溶液配方)
  18. 葡聚糖(Dextran)水溶液(见溶液配方)

仪器设备

  1. 生物分子相互作用分析仪(Cytiva,Cytiva,catalog number: Biacore T200)
  2. 微孔板恒温振荡器(杭州米欧仪器有限公司,MIU LAB,catalog number: ST70-2)
  3. 氮吹仪(杭州米欧仪器有限公司,MIU LAB,catalog number: NDK200-1N)
  4. 干式金属浴(杭州米欧仪器有限公司,MIU LAB,catalog number: DHT-100)

实验步骤

  1. 回收芯片,获得金膜芯片
    将废弃的生物传感芯片从芯片外壳中取出,浸泡于80%乙醇溶液中24 h,使硅胶溶解 以取下沾在塑料框架上的金膜芯片。室温下,将金膜放置于24孔板并浸泡于2 mL 98% H2SO4/30% H2O2溶液中,300 rpm振荡浸洗30 min,中间翻转金膜数次,去掉金膜表面包括失活的配体分子、葡聚糖凝胶和11-巯基十一醇等有机成分,去离子水洗5次,氮气吹干后,得到具有裸金表面的金膜芯片(实验体系参考李雪玲等[1])。
  2. 重构芯片表面基质
    将金膜芯片置于5 mL离心管中,加入2 mL 5 mM 11-巯基十一醇溶液,将离心管放置于金属浴中40 ℃孵育30 min,然后依次用80%乙醇、去离子水各洗5次,11-巯基十一醇作为功能结构可进一步修饰,同时阻止生物分子的非特异性吸附。将上面处理过的芯片加入0.6 M表氯醇溶液中,在金属浴中25 ℃孵育4 h,依次用去离子水洗2次,80%乙醇洗两次,去离子水洗5次,表氯醇处理生成环氧基用于下一步葡聚糖共价修饰(实验条件参考欧惠超等[2])。
  3. 葡聚糖修饰及羧基化,获得CM芯片
    将重构基质后的金膜芯片置于24孔板,浸泡于2 mL不同浓度的葡聚糖(Dextran)水溶液中,25 ℃下300 rpm振荡孵育20 h,50 ℃去离子水洗5次。将上述Dextran修饰后的金膜芯片加入1 M溴乙酸中,25 ℃下300 rpm振荡孵育18 h,使Dextran凝胶羧基化,去离子水洗5次,氮气吹干,得到CM芯片。


    图 1. 生物传感芯片回收与重制实验流程示意图

  4. 芯片组装
    利用SIA Kit Au中的工具包,将重制后的CM芯片用裁剪好的透明双面胶粘贴于塑料框架上,并插入芯片外壳。芯片组装完成后,放入自封袋4 ℃储存。


    图 2. SPR芯片组装示意图

实验注意要点

  1. 组装芯片时,注意区分芯片的正反面,即经过化学修饰的金膜面和玻璃基底面。一旦用透明双面胶错误粘贴,则芯片无法再次取下、重新组装。
  2. 粘贴、按压芯片不宜用力过大,以免导致玻璃基底断裂,导致芯片无法使用。

结果与数据分析

  1. 芯片偶联量测试
    采用牛血清蛋白(bovine serum albumin,BSA)作为实验样本,检测重制CM芯片的偶联量,同时参考芯片活化的ΔR值,依次考察pH值、葡聚糖浓度和种类的影响,优化CM芯片的重制条件。偶联实验条件如下:
    重制CM芯片采用N-羟基丁二酰亚胺(N-Hydroxysuccinimide,EDC)和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride,NHS)混合液(体积比1:1)预先活化420 s,然后将醋酸钠缓冲盐溶液(pH=4.0)稀释BSA的100 μg/mL溶液进样420 s,随后用乙醇胺盐酸盐进行封闭进样420 s(图3)。对比BSA蛋白偶联前后的SPR曲线差值可以得知蛋白偶联量,由于实验中采用了较大的BSA浓度和较长的进样时间,因此该偶联量可以反映出芯片蛋白偶联量的最大能力(偶联性能评价参考沈广宇等[3])。对比活化前后的SPR曲线差值ΔR则可以反应出芯片表面可用于偶联的活性位点的多少,通常与芯片偶联蛋白容量大小是一致的。


    图3. CM芯片偶联性能测试示意图

  2. 重构基质阶段pH值的影响:


    图 4. 不同pH值下重制CM芯片单通道最大偶联量

    实验初期,采用类似正交实验的方法,初步考察在重构基质阶段pH值及葡聚糖浓度对于芯片偶联蛋白量的影响(图4),可以看到在0.1 M NaOH条件下,重制CM芯片就能获得一个较高的蛋白偶联量,因此,在后续的实验中,重构基质的pH条件均采用0.1 M NaOH。另外,当葡聚糖浓度增大到一定含量后,重制CM芯片的蛋白偶联量反而下降。
    用于修饰的葡聚糖种类的影响
    本实验中用到的葡聚糖为右旋糖苷(Dextran),是一类种类丰富的多糖。为了优化出合适的Dextran,实验考察了采用四种不同分子量的Dextran(Mw = 1500、25000、60000 以及500000 g/mol)对重制CM芯片单通道最大偶联量的影响(图5),可以看出,采用分子量较大的Dextran用于修饰芯片,可以获得较高的蛋白偶联量,Dextran-500000及Dextran-25000所修饰的芯片都具备较好的蛋白耦连能力。另外,对于同一Dextran,葡聚糖浓度提高时,并不总是对应蛋白的偶联量的提高,尤其是对于较大分子量的Dextran而言。另外,考察CM芯片蛋白偶联能力时,可以参考ΔR值的大小(图5内插图),ΔR值的变化趋势与蛋白最大偶联量基本保持一致。


    图 5. 修饰不同分子量葡聚糖下重制CM芯片单通道最大偶联量

溶液配方

  1. 98% H2SO4/30% H2O2(7:3)溶液
    即食人鱼洗液,用量筒分别量取体积比为7:3的98% H2SO4及30% H2O2,先将浓硫酸倒入烧杯中,再将30% H2O2缓慢滴入浓硫酸中,同时用玻璃棒不停搅拌。食人鱼洗液每次使用前现用现配,使用后的食人鱼洗液经纯水稀释后倒入酸液废液桶中。
  2. 11-巯基十一醇溶液
    称量一定质量的11-巯基十一醇粉末,溶于80%乙醇中,使得11-巯基十一醇终浓度为5 mM,溶液储存于棕色容量瓶中,室温避光存放。
  3. 表氯醇溶液
    先配制体积比为1:1的0.4 M NaOH和二乙二醇二甲醚溶液,并将二者混匀,然后量取一定体积的环氧氯丙烷,溶于上述溶剂中,使得环氧氯丙烷的终浓度为0.6 M,溶液储存于棕色容量瓶中,室温避光存放。
  4. 葡聚糖(Dextran)水溶液:以 0.3 g/L Dextran-60000葡聚糖溶液为例:称量0.025 g的Dextran-60000葡聚糖粉末,溶于5 mL去离子水中,使得葡聚糖储液浓度为5 mg/mL,然后量取120 μL的葡聚糖储液与100 μL的2 M NaOH储液混合,再用1780 μL去离子水稀释,使得溶液中葡聚糖终浓度为0.3g/L且NaOH终浓度为0.1 M,葡聚糖溶液应现用现配,葡聚糖储液及2 M NaOH储液可4 ℃冷藏存放。
  5. 溴乙酸:称量一定质量的溴乙酸粉末,溶于2 M NaOH溶液中,使得溴乙酸终浓度为1 M,溶液储存于玻璃溶剂瓶中,室温存放。

致谢

本研究得到了“南开大学大型仪器实验技术研发项目”的资助,感谢南开大学及设备处对于大型仪器技术、方法开发等工作的大力支持。本实验方法着重参考了欧惠超博士的研究工作“基于SPR技术的传感芯片的研制及其应用”,在此致谢欧惠超、罗昭峰和宋存先等老师的研究工作。

参考文献

  1. 李雪玲,方志俊 ,黄明辉,曹慧敏,赵建龙,杨梦苏.(2007) 一种葡聚糖芯片的再生方法、表征及其应用. 中国生物工程杂志,27:59-62.
  2. 欧惠超,姜 浩,周宏敏,李磊珂,白林静,宋存先,罗昭锋.(2009) 五种 SPR传感芯片的再生制备及其应用. 中国生物工程杂志,29:44-49.
  3. Shen G. Y., Wang S., Wang H., Tan S. Z., Li J. S., Shen G. L. and Yu R. Q.(2005) Detection of antisperm antibody in human serum using a piezoelectric immunosensor based on mixed self-assembled monolayers. Analytica Chimica Acta, 540:279-284.
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Copyright: © 2024 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC.
引用格式:郭爽, 管祥辰. (2024). 生物传感芯片的回收及CM芯片的重制. Bio-101: e1011013. DOI: 10.21769/BioProtoc.1011013.
How to cite: Guo, S. and Guan, X. C. (2024). Recovery of Biosensor Chips and Remake of CM Chip. Bio-101: e1011013. DOI: 10.21769/BioProtoc.1011013.
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