基于微生物光电效应的典型硫酸盐还原菌定向富集方法
Targeted enrichment of typical sulphate-reducing bacteria based on microbial photoelectric effect   

基本原理

SRB是一类兼性厌氧原核生物的总称，是AMD生物处理的关键微生物，可以利用有机物(电子供体)将AMD中的硫酸盐(电子受体)还原为硫化氢，同时释放碱度[1]。AMD中的金属离子进一步与S2-形成溶解度很低的金属硫化物沉淀，从而达到降低AMD危害的作用[2]。SRB的富集往往需要投入较多碳源作为电子供体，而微生物光电效应也显示了光电子作为微生物外源电子进行生长代谢的可能[3,4]。因此本方法基于微生物光电效应，利用典型光敏剂的光激发电子可以被SRB捕获并用于自身的代谢活动和硫酸盐还原原理，实现了典型硫酸盐还原菌定向富集，并有效提高了AMD中硫酸盐的还原与去除。

材料与试剂

1. 环境样本（本实验为某矿区土壤为例）
2. 光敏剂（以蒽醌-2-磺酸钠为例）
3. DNA提取试剂盒（MP Biomedicals, USA）
   

仪器设备

1. 氙灯（CEL-HXF300, 中教金源，中国）
2. 电化学工作站（CHI760E，辰华，中国上海）
3. Qubit 3.0 荧光计（ThermoFisher Scientific, USA）
   

实验步骤

一、土壤样品的采集

由于酸性矿山废水中含有大量变价金属，受污染农田中耐受微生物丰度较高，因此于长期受酸性矿山废水影响的农田采集次表层土壤用于本研究。这些土壤样品在室温下干燥，用2 mm筛网筛过，并在-20 °C保存以供进一步分析。

二、SRB的富集

将采集的酸性矿区土壤接种到120 mL可密封的厌氧瓶中，接种量为5 g，加入100 mL培养液和光敏剂，并加入过滤灭菌的5%硫酸亚铁铵作为硫化氢指示剂。混匀后往培养瓶中通入氩气15 min以排除氧气干扰，将培养瓶放在装有AM1.5滤光片的300 W氙灯下光照培养；当培养瓶中溶液变黑并观察到有小气泡产出时，表明SRB初步富集完成。改进培养液主要成分为：柠檬酸钠：5 g/L，乳酸钠：3.5 g/L，酵母提取物：1 g/L，MgSO₄：2 g/L，CaSO₄：2 g/L，NH₄Cl：1 g/L，K₂HPO₄：0.5 g/L，并加入1 mM蒽醌-2-磺酸盐（AQS）作为光敏剂[5]。

三、光电化学表征

使用CHI760E电化学工作站，在0.1 M pH = 7的磷酸缓冲盐水(PBS)中构建三电极系统，其中氧化铟锡(ITO)玻璃为工作电极，铂板为工作电极，饱和甘汞电极(SEC)为参比电极。记录i- t曲线，施加电位为0.3 V vs SCE[6]。采用装有AM1.5滤光片的300 W氙灯作为光源。在缓冲液中加入不同浓度（0.5 mM、1 mM、2 mM）的光敏剂，探究不同光敏剂浓度对光生电流大小的影响。改变氙灯辐照位置，探究不同光照强度（1200 mW·cm^-2、800 mW·cm^-2、400 mW·cm^-2）对光生电流大小的影响。

四、辐照对硫酸盐光电还原作用的批次实验

将富集得到的菌液按一定比例接种于四组不同条件的120 mL培养瓶中。分别为对照组；灭菌组：接种后将培养瓶进行高温灭菌；黑暗组：将接种后的培养瓶用锡纸包裹并放在暗处培养；无光敏剂组：不添加光敏剂。详细实验设计见表1。接种完毕后往上述四组培养瓶通入氩气15 min，之后除黑暗组外其余三组放在装有AM1.5滤光片的300 W氙灯下培养，使用光密度计将氙灯调节到最适光照强度，明暗循环(每个周期12小时)模拟白天和黑夜。使用1mL注射器每两天对批次实验中培养液进行取样，过滤稀释后用离子色谱法[7]对硫酸盐浓度进行检测，每个组别3次重复。

表1 各组批次实验条件

五、微生物群落分析

1. 提取DNA
   （1）在批次培养过程中定期打开一个培养瓶，静置沉淀一段时间后倒掉部分上清液，将剩余泥水混合物小心转移至50 mL离心管后离心15 min (7,500× g)；
   （2）倒掉上清液，仅保留湿土用于DNA的提取；
   （3）使用DNA提取试剂盒提取样品的基因组DNA；
   （4）利用Qubit测定所提取的DNA浓度，将符合要求的样品进行扩增子测序。
2. 16S rRNA基因扩增子测序
   为分析批处理SRB微生物组成的变化，利用条形码338F/806R引物靶向细菌16S rRNA基因V3-V4区进行微生物群落分析[8]。纯化的PCR产物在Personal Bio公司的Illumina Miseq PE300平台上进行高通量测序。16S rRNA基因序列数据采用QIIME2流程处理。使用DADA2算法对过滤后的读取进行降噪以生成扩增子序列变体(ASV)。利用SILVA数据库v13.8对获得的ASV序列进行分类。基于MicrobiomeAnalyst分析平台对ASV分析群落组成和多样性。

结果与分析

1. 光电化学表征
   使用CHI760E电化学工作站构建三电极系统对光敏剂的光敏性进行表征。结果如图2所示。在打开氙灯时，系统中产生了明显的光电流，在光敏剂的浓度为1 mM时产生的光生电流最大，电流从0.8 μA提升到2.5 μA，并且在后续照射的过程中逐渐增大。0.5 mM 光敏剂和2 mM 光敏剂产生的光生电流分别为和1.5 μA和2.0 μA。光照强度也会显著影响光电流的强度，结果如图3所示。光照强度越大，产生的光电流越大，当光照强度为1200 mW·cm-2时产生的峰值电流最高。
   
   
   图1. 不同光敏剂浓度光生电流大小示意图
   
   
   图2. 不同光照强度光生电流大小示意图
   
   
2. 批次实验结果
   在光照条件下光敏剂会产生光生电子，进而被SRB所利用进行硫酸盐还原。每两天对批次实验中培养液进行采样，并用离子色谱法对硫酸盐浓度进行检测，可以得到图3。可以看出，随着培养时间的延长，SRB利用体系中唯一电子受体硫酸根进行呼吸，使得硫酸盐含量不断下降。在对照组中实现了硫酸盐的高效去除，在30天的连续监测中达到了40%的硫酸盐去除率，比黑暗组中增强了近60%。在灭菌组中硫酸盐的含量则没有明显的变化。对照组的硫酸盐还原速率明显高于黑暗组和无光敏剂组，说明光照和光敏剂缺一不可。
   
   
   图3. 不同处理硫酸盐含量变化情况示意图
   
   
3. 高通量测序
   将培养10天的样品进行16S rRNA高通量测序可得图4。我们可以发现在改进的培养基和光照条件下，作为典型SRB的Desulfosporosinus的相对丰度在对照组中达到了5%，分别是黑暗组（0.02%）、无光敏剂组（0.7%）的200倍、7倍以上，说明本方法可有效的定向富集典型SRB。
   
   
   图4. 不同处理下典型SRB的相对丰度大小
   

结论

本文通过将微生物光电效应引入到典型硫酸盐还原菌的富集方法之中，验证了溶解性有机质光敏剂的光敏性，并且探究了不同实验方案对产生光生电流大小的影响，为酸性矿山废水的处理提供了一种新的思路，即利用光照强化典型SRB的富集，以促进硫酸盐的还原，达到减少碳源投入和处理速率提升的双重作用。读者可以根据自身实验的需要，通过引入光照和光敏剂的条件对目标微生物进行富集培养，并结合微生物组学技术，验证实验目标菌群的成功富集。

致谢

感谢湖南省自然科学基金杰出青年项目(2024JJ2072)和国家自然科学基金面上基金项目(42377033)对本工作的大力支持。

参考文献

1. Sato, Y., Hamai, T., Hori, T., Aoyagi, T., Inaba, T., Kobayashi, M., Habe, H. and Sakata, T. (2019). Desulfosporosinus spp. were the most predominant sulfate-reducing bacteria in pilot- and laboratory-scale passive bioreactors for acid mine drainage treatment. Appl Microbiol Biotechnol. 103(18): 7783–7793. https://doi.org/10.1007/s00253-019-10063-2
2. Zhang, Z., Zhang, C., Yang, Y., Zhang, Z., Tang, Y., Su, P. and Lin, Z. (2022). A review of sulfate-reducing bacteria: Metabolism, influencing factors and application in wastewater treatment. J Cleaner Prod. 376: 134109. https://doi.org/10.1016/j.jclepro.2022.134109
3. Magowo, W. E., Sheridan, C. and Rumbold, K. (2020). Global Co-occurrence of Acid Mine Drainage and Organic Rich Industrial and Domestic Effluent: Biological sulfate reduction as a co-treatment-option. J Water Process Eng. 38: 101650. https://doi.org/10.1016/j.jwpe.2020.101650
4. Huang, S., Chen, M., Diao, Y., Feng, Q., Zeng, R. J. and Zhou, S. (2022). Dissolved Organic Matter Acting as a Microbial Photosensitizer Drives Photoelectrotrophic Denitrification. Environ Sci Technol. 56(7): 4632–4641. https://doi.org/10.1021/acs.est.1c07556
5. Chen, M., Cai, Q., Chen, X., Huang, S., Feng, Q., Majima, T., Zeng, R. J. and Zhou, S. (2022). Anthraquinone-2-Sulfonate as a Microbial Photosensitizer and Capacitor Drives Solar-to-N₂O Production with a Quantum Efficiency of Almost Unity. Environ Sci Technol. 56(8): 5161–5169. https://doi.org/10.1021/acs.est.1c08710
6. Huang, S., Chen, K., Chen, X., Liao, H., Zeng, R. J., Zhou, S. and Chen, M. (2023). Sunlight Significantly Enhances Soil Denitrification via an Interfacial Biophotoelectrochemical Pathway. Environmental Science & Technology 57(20): 7733–7742. https://doi.org/10.1021/acs.est.3c00236
7. Nielsen, G., Coudert, L., Janin, A., Blais, J. F. and Mercier, G. (2019). Influence of Organic Carbon Sources on Metal Removal from Mine Impacted Water Using Sulfate-Reducing Bacteria Bioreactors in Cold Climates. Mine Water Environ. 38(1): 104–118. https://doi.org/10.1007/s10230-018-00580-3
8. Xu, R., Li, B., Xiao, E., Young, L. Y., Sun, X., Kong, T., Dong, Y., Wang, Q., Yang, Z., Chen, L., et al. (2020). Uncovering microbial responses to sharp geochemical gradients in a terrace contaminated by acid mine drainage. Environ Pollut. 261: 114226. https://doi.org/10.1016/j.envpol.2020.114226