矿区先锋植物根内生促生菌的高效分离与群落稳定构建
The Efficient Isolation of Growth-Promoting Endophytic Bacteria from Pioneer Plants in Mining Areas and the Stable Construction of Microbial Communities   

研究背景

在矿山生态修复过程中，植物面临金属胁迫和寡营养等挑战，导致生态修复效果不佳。而先锋植物微生物组通过固氮、溶磷和分泌铁载体等机制，促进植物生长和营养吸收，并通过螯合或转化金属，降低重金属毒性，增强植物耐受性[1]。因此，根际微生物接种已成为促进植物修复的重要方法[2]。尽管商业菌株的应用已相当普遍，但其在根际中的定植和功能发挥受到环境显著影响[3]，且由于缺乏对多样宿主的适应性，商业菌株的功效往往不够可靠，导致预期效果不佳[4]。而根系土著微生物更能适应当地环境，具有更好的定植效果和功能表现[5]。因此，快速筛选适宜分选的根际样品，并原位分离具有促生潜力的微生物至关重要。目前，常用传统平板划线分离方法分离目标功能菌株，但这种方法繁琐且周期长，分离效果差[6]。相比之下，通过极限稀释结合96孔培养板的分离能够显著提高分离效率，可以在短时间内获得大量纯种菌株，并结合基因测序，可快速获取微生物的遗传信息及代谢功能。考虑到单一微生物的功能有限难以适应复杂的环境，由单菌合成得到的低复杂性和高可控性的SynCom的研究也越来越受到关注[7]。例如，土著SynCom可通过多种植物促生机制有效提高植物的生产力和抵御胁迫的能力[8,9]。这些SynCom还能与原生土壤中的植物宿主共同进化，尤其是在矿区等营养有限的环境条件下，土著SynCom对土壤功能和植物发育具有持久的积极影响[10]。因此，如何选择功能互补且稳定的菌群成员并构建有效的SynCom成为当前研究的重点。基于此，本研究提出了一种用于识别、分离、高效合成矿区先锋植物根际促生菌群的方法。

主要流程
首先快速判断和筛选出具有分选潜力的先锋植物根际样品。随后，采用极限稀释结合96孔培养板的方法对这些样品中的根际微生物进行高效分离，并通过基因测序获取其遗传信息和代谢功能。最后，基于所筛选出的功能菌株，构建低复杂性且高可控性的合成菌群，并通过植物促生实验验证其在矿区生态修复中的潜力（图1)。


图 1. 本文工作流程示意图

材料与试剂

1. 移液器枪头
2. EP管
3. 50 mL离心管
4. 96孔细胞培养板（比克曼）
5. Parafilm封口膜 （比克曼）
6. 0.22 μm 无菌过滤膜（比克曼）
7. PCR板 （比克曼）
8. 营养土壤
9. 珍珠岩
10. 蛭石
11. 营养钵
12. 次氯酸钠（上海国药，分析纯）
13. 氯化镁（上海国药，分析纯）
14. 酒石酸锑钾（上海国药，分析纯）
15. 70%乙醇溶液
16. 琼脂粉（上海国药，分析纯）
17. 无菌去离子水
18. 磷酸缓冲液 （biosharp）
19. FeCl₃（上海国药，分析纯）
20. 浓H₂SO₄（上海国药，分析纯）
21. 吲哚乙酸（上海国药，分析纯）
22. 拟南芥（野生型 col-0）
23. 甘油（上海国药，分析纯）
24. 液氮
25. 大肠杆菌DH5α（Thermo Scientific）
26. Loading Buffer（Biosharp BL532A）
27. 碱裂解Buffer I（25 mM NaOH and 0.2 mM Na2—EDTA，pH = 12）（Biosharp BL532A）
28. 中和缓冲液Buffer II（40 mM Tris-HCI，pH=7）（Biosharp BL532A）
29. 2.5%有效氯浓度的次氯酸钠溶液（见溶液配方）
30. 1/2 MS 固体培养基（见溶液配方）（比克曼）
31. 1/10 TSB 液体培养基（见溶液配方）（青岛海博）
32. LB 液体培养基（见溶液配方）
33. 无机磷培养基（见溶液配方）（青岛海博）
34. Ashby无氮培养基（见溶液配方）（青岛海博）
35. CAS培养基（见溶液配方）（青岛海博）
36. R2A固体培养基（见溶液配方）（青岛海博）
37. SV Gel and PCR Clean-up System试剂盒
38. Quant-iTTM PicoGreenTM dsDNA Assay Kit分析试剂盒
39. DNeasy Powersole试剂盒（Qiagen，Dresden，德国）
    

仪器设备

1. 生物安全柜/超净工作台（Thermo Fisher, 1300 Series A2）
2. 高压蒸汽灭菌锅（力辰，DGL-35G）
3. 可见分光光度计（北京普析，T400F）
4. 电子天平（力辰，LC-FA2004）
5. 高速离心机（Eppendorf, 5810r）
6. 八通道移液器（Thermo, Scientific）
7. 三角锥型瓶（蜀牛）
8. 微孔板离心机（迈克尔，MK-30）
9. 恒温培养摇床（一恒，THZ）
10. 超低温冰箱（Thermo, 906-Ults）
11. PCR仪（Bio-Rad, CFX96）
12. 凝胶电泳仪（伯兰特，DYCP-31DN）
    

实验步骤

一、分选潜力样品的快速判别

1. 从矿区自然土壤中采集植物新鲜根系样品，使用冰袋运回实验室。为了保证样品中微生物的活性，样品应尽量在4小时内运达实验室进行下一步分析。采集先锋植物（如芒草）的新鲜根系样品约10 g，首先用自来水将肉眼可见的土壤颗粒洗掉。接着将根系转移至新的50 mL离心管，管中加入30 mL磷酸缓冲液，在室温条件下，放置在平板摇床上用180 rpm的转速清洗15 min，重复清洗3遍。最后，用无菌滤纸吸取根系残留液体。
2. 将根系研磨成匀浆。将清洗并吸水后的根系组织用无菌剪刀尽可能剪成小段，并混合均匀。称取2 g的根系组织放入1.5 mL的无菌离心管。在生物安全柜中，向离心管中加入200 μL灭菌的10 mM的氯化镁溶液，用无菌研磨棒研磨根系直至成匀浆状，取混匀的根系组织用于检测根系微生物组。
3. DNA提取和扩增
   使用DNeasy Powersole试剂盒提取内生菌DNA。将基因组DNA作为模板，扩增其V5V7高变区。以799F为正向引物，以1193R为反向引物进行PCR扩增；已知菌液大肠杆菌DH5α为模板的阳性对照，灭菌去离子水为模板的阴性对照；PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，配制1.2％的琼脂糖凝胶，电压设置120 V，电泳约20–40 min。阳性对照目的条带位置正确，阴性对照无条带，表明PCR扩增合格。切取16S rRNA基因的PCR扩增片段（约500 bp）以及该片段上下2 mm凝胶内的所有片段，然后将胶块装入2 mL无菌离心管，用SV Gel and PCR Clean-up System试剂盒进行切胶回收，得到各孔细菌的16SrRNA基因的PCR纯化样本。DNA浓度由Quant-iTTMPicoGreenTM dsDNA Assay Kit分析试剂盒（Invitrogen公司）测定，并以等量DNA的标准混合细菌DNA样本，得到测序鉴定文库。
4. 测序和生信分析：对鉴定文库在Hiseq2500平台上进行测序，得到根系细菌的非冗余序列，每个序列包含一个barcode和16S rRNA基因V5-V7序列。根据barcode对序列进行质量过滤和样本拆分，通过UNOISE算法，去除嵌合体和低丰度序列（读取计数<8）后定义identity = 100%的序列为ASV。将培养细菌16SrRNA基因V5-V7序列与Silva （https://www.arb-silva.de/）数据库中的细菌16S rRNA基因的V5-V7序列进行比较，采用SINTAX算法对细菌ASV进行分类注释。对其进行PICRUSt2基因预测，功能基因参考KEGG数据库，以植物促生相关功能基因为筛选阈值，具体可根据实验目的进行调整。
5. 当根际微生物群落的PICRUSt2基因预测结果显示具有显著表达的与植物促生相关的功能基因（如ipdC、acrA、mbtH、nifH等）和与特定污染物抗性相关的基因（如aioA、arsA、czcD等）时，可判定该根系样品具有分选潜力，适合作为进一步分离与研究的候选样品。
   
   
   

推荐例：
砷/锑污染土壤：锑抗性相关基因aioA（K08356），arsA（K01551），arsB（K03325），arsC（K03741）。
镉污染土壤：czcD（K16264），zipB（K16267），cmtR（K21885），cadC（K21903）
植物促生: ipdC（K04103），acrA（K03585），mbtH（K05375），nifH（K02588）

二、根系微生物的高效分选与功能验证

1. 根系微生物高效分选（图2）
   
   1. 重复上述根系分离步骤，将得到的根系匀浆液转至含有25 mL的10 mM氯化镁的50 mL管中，混匀，室温下静置15 min。在生物安全柜中，例如将菌液按照10万倍，100万倍，1,000万倍，1亿倍稀释倍数加入到含有0.1 mM Sb³⁺ 的灭菌10% TSB溶液的4个瓶中。摇匀每瓶稀释液，将部分稀释液倒入无菌培养皿中，用排枪吸取液体移入96孔细胞培养板的每个孔中，每孔160 μL，每瓶稀释液转移3个细胞培养板，未添加根系匀浆的灭菌10%TSB溶液转移3个细胞培养板作为阴性对照。用Parafilm将每一个细胞培养板封口，反复仔细多刮表面多次。移液时应尽量避免液体溅到孔外，否则容易造成污染。避光一周后寻找与30%浑浊度最接近的稀释倍数作为最适稀释浓度（ODC），重新按照上述步骤研磨根系匀浆，并分别按1/3× ODC、ODC和3× ODC稀释浓度用0.1 mM Sb³⁺ 的10%TSB溶液配制稀释液。将稀释液转移至96孔板，放置在室温下孵育2周。二周后观察96孔细胞培养板中细菌的生长情况，保留约30%的孔呈现肉眼可见的浑浊状态的培养板。用微孔板离心机将板内液体离心至管底再揭开PCR封板膜以避免污染。用移液枪从培养板孔中吸取20 μL样品移入灭菌EP管中，存储在-20 °C冰箱用于后期细菌鉴定。每孔剩余样品中转移新的灭菌EP管并添加140 μL的80%灭菌甘油，使用液氮速冻后存储在-80 °C冰箱。
   2. 菌孔DNA的提取鉴定（本步骤也可以经后续功能鉴定后再选择所需目的菌孔进行鉴定）：采用碱解法提取培养细菌的DNA。向20 µL样品移入灭菌EP管中加入20 μL碱性裂解液。将上述体系用排枪吹打混匀后用扣盖，在水浴锅（95 °C，30min）裂解菌体。冷却降温后，向每孔中加入20 µL中和缓冲液，混匀并离心，存储于-20 °C冰箱。再参考上述步骤对DNA进行扩增和生信分析。
   3. 取-80 °C冰箱冻存菌株在LB固体培养基中活化后，挑取单菌落转接至20 mL LB液体培养基中，置于28 °C、转速180 r/min条件下的恒温培养摇床中过夜培养。将富集培养的菌液，使用可见光分光光度计调整菌液浓度至OD₆₀₀ = 0.5后，用于下一步接种。
   
   
   图 2. 菌群高效分离示意图
   
   
2. 菌群常见促生功能验证（根据目的选择）（图3）：
   1. 溶磷功能研究：取1 μL OD₆₀₀ = 0.5的菌液接种于无机磷培养基上，每株重复3次，37 °C培养7 d。观察有无溶磷圈产生，以接种1 μL的空白LB培养基为对照组。
   2. 固氮功能研究：取1 μL OD₆₀₀ = 0.5的菌液接种于Ashby无氮培养基7 d，观察其生长情况和菌落周围是否出现透明圈，如出现透明圈则该菌株具有固氮能力，以接种1 μL的空白LB培养基为对照组。
   3. 产铁载体功能研究：取1 μL OD₆₀₀ = 0.5的菌液接种于CAS培养基，37 d，观察其生长情况，观察菌落周围是否出现黄色圈，如出现黄色圈则该菌株具有产铁载体功能，以接种1 μL 的空白LB培养基为对照组。
   4. 产IAA功能定性测定：供试菌株接种于100 mL LB液体培养基（加入0.5 g/L色氨酸）。置于30 °C摇床，180 r/min 4 d。取菌悬液10,000 r/min离心5 min，取上清液1 mL于10 mL，同时加入4 mL比色液（30 mL浓H₂SO₄，1.5 mL 0.5 mol/L比色液 FeCl₃，50 mL蒸馏水），标准对照在比色液中加入1 mL 50 mg/L的吲哚乙酸标准品，空白对照加入1 mL培养基和4 mL比色液。所有EP管于室温避光放置30 min后观察，颜色变红者表示能够分泌IAA。
   5. 金属耐受测定：使用的培养基为LB液体培养基，加入重金属溶液（可根据需要设置浓度梯度），设置3个平行组以及1个空白对照（不接种菌），每组配制250 mL培养液，进行高温灭菌（121 °C，20 min），在超净工作台上冷却至适宜温度后，接入1%的菌液，锥形瓶均放到30 °C、150 rpm的摇床中培养，实验持续3天。每间隔12或24小时用可见光分光光度计测定其OD₆₀₀并绘制生长曲线。
   6. 如所选重金属为变价金属（砷锑），可同步每间隔12或24小时测定一次氧化/还原情况，绘制氧化/还原曲线。曲线测定时，先将样品在50,00 rpm下离心5 min，取上清液，使用原子荧光测定其中砷锑（III）的浓度，绘制浓度曲线。
   
   
   
   图 3. 功能验证示意图（溶磷，固氮为例）
   

三、生态稳态构建及植物促生功能验证

1. 菌株互作
   1. 平板对峙实验：使用可见光可见分光光度计测定菌液浓度，将浓度调节至OD₆₀₀ = 0.5；吸取7次1 μL稀释液依次接种至R2A固体培养基的方形培养皿的两侧对角线，接种点间逐渐靠近呈现一个“V”型。封口膜密封后，20 °C孵育7天，在垂直于“V”型的直线上观察菌落生长情况，并对菌落直径进行测量。选择互利共生的菌株构建合成菌群进行进一步实验。本方法用来探究挥发性物质对菌群的影响（图4）。
      
      
      图 4. 平板对峙示意图
      
      
   2. 液体互作实验：将两种细菌分别接种到20毫升的LB培养基中，并在37 °C、180 r/min的条件下孵育48小时，直至达到稳定期。然后，将细菌培养液以8,000 r/min离心10分钟，收集上清液（SM），并通过0.22 μm的无菌滤膜过滤。将每种细菌的细菌悬液调整到相同的光密度（OD₆₀₀ = 0.1），确保细菌数量相同，并以1%的体积比接种到另一种细菌的SM中，在37 °C下孵育48小时。作为对照，将每种调整好的细菌悬液分别接种到新鲜的LB培养基中。孵育结束后，测量所有培养液的OD₆₀₀值，表示细菌的生长量。结果表示为细菌在不同SM中的OD₆₀₀值除以同一种细菌在新鲜LB培养基中的OD₆₀₀值（即OD₆₀₀ SM/新鲜）。本方法用来探究非挥发性代谢物质对菌群的影响。
      合成菌群的构建则根据以上结果进行综合判断，按照菌OD₆₀₀ = 0.5，体积比为1:1的结果来进行构建。
      
2. 植物促生验证（图5）
   1. 挑选一批籽粒饱满的野生型拟南芥种子，置于无菌的锥形瓶中，加入75%的酒精浸泡5 min，然后用无菌水清洗4次；使用2% NaClO溶液浸润浸泡10 min，期间不断摇晃，随后使用无菌水清洗6次，将种子表面的NaClO清洗干净。将拟南芥种子点在1/2 MS的隔板培养基上，置于4 °C的冰箱春化48 h（以上步骤均在超净工作台中进行）。将无菌培养体系置于25 °C，16 h光照，25%湿度的培养间内培养7 d。将营养土壤、珍珠岩和蛭石按照体积比（3:1:1）混合均匀，在间隔24 h的高压121°C 20 min的灭菌条件下处理3次后烘干使用。将上述混合基质装入黑色营养钵后，取培养7天的拟南芥洗净根部残留培养基竖直放入基质中。置于25 °C，16 h光照，25%湿度的培养间内培养10 d（约4片真叶）后进行下一步处理。
   2. 将富集培养的菌液分别转移到50 mL的无菌离心管中，5,000 r/min、离心10 min后，于超净工作台中将其上清废弃；加入无菌水吸打均匀，置于上述离心条件再次离心，废弃上清（重复两次）；加入无菌水重悬，使用可见光分光光度计调整菌液浓度至OD₆₀₀ = 0.5后，按照菌液体积比基质重量为1:100的比例将菌液接种至营养钵内。若添加的微生物为混合菌群，将各成员按1:1等比例混合均匀后，再次测量并调整OD₆₀₀至0.5，按比例添加至黑色营养钵内。可根据实验需要添加重金属，盐碱胁迫。继续置于25 °C，16 h光照，25%湿度的培养间内培养。
      
      

图 5. 合成菌群植物促生示意图

成功经验/失败经验

1. 在含有胁迫的筛选培养基分选中，选择整体浑浊度低于30%的培养板。
2. 可以利用96孔板进行所需功能筛选后测序，以减少非必要功能菌的获得。
3. 合成菌群选择互利共生菌株（至少不拮抗），最好选择功能互补的菌株，能够充分利用生态位
   

溶液配方

1. LB 液体培养基
   蛋白胨10 g；酵母粉5 g；NaCl 8 g；蒸馏水1,000 mL；pH7.0–7.2。
2. 1/10 TSB 液体培养基
   胰酪胨17.0 g；氯化钠5.0 g；大豆木瓜蛋白酶水解物3.0 g；磷酸氢二钾2.5 g；葡萄糖2.5 g；
3. 无菌去离子水
   去离子水经过121 °C高压灭菌15 min。
4. 磷酸缓冲液
   取磷酸二氢钾0.68 g，加0.1 mol/L氢氧化钠溶液29.1 mL，用水稀释至100 mL。
5. 无机磷培养基
   葡萄糖 10.0 g；硫酸铵 0.5 g；酵母浸粉 0.5 g；氯化钠 0.3 g；氯化钾0.3 g；硫酸镁0.3 g；硫酸亚铁0. 03 g；硫酸锰0.03 g；磷酸三钙5.0 g；pH值7.0-7.5。
6. Ashby无氮培养基
   磷酸二氢钾 0.2 g；硫酸镁0.2 g；氯化钠0.2 g；碳酸钙5.0 g；甘露醇10.0 g；硫酸钙 0.1 g；pH值7.0 ± 0.1。
7. CAS培养基
   铬天青S（CAS） 60.5 mg；十六烷基三甲基溴化铵（HDTMA） 72.9 mg；六水氯化铁 2.645 mg；二水磷酸二氢钠 295.25 mg；十二水磷酸氢二钠 1213.5 mg；氯化铵 125 mg；磷酸二氢钾 37.5 mg；氯化钠 62.5 mg；琼脂 9,000 mg；pH值6.8 ± 0.1。
8. 1/2 MS 培养基
   Murashige Skoog培养基（含维生素）干粉：2.2 g；蔗糖10 g；琼脂粉8 g； pH 值5.8。
9. 2.5%有效氯浓度的NaClO溶液
   100 mL 无菌去离子水加上 3 mL NaClO。
10. 25 μL PCR扩增体系
    1 μL模板DNA、0.25 μL Fast pfu DNA聚合酶、5 μL 5× PCR Buffer（Mg2+ Plus）、2 μL dNTPs、1 μL正向引物799F和1 μL反向引物1193R、14.75 μL ddH₂O。
    1. 799F：5’-AACMGGATTAGATACCCKG-3’
    2. 1193R：5’-ACGTCATCCCCACCTTCC-3’
    灭菌要求：121 °C高压灭菌15 min，于超净台中分装，在4 °C条件下可存储数周。
    PCR条件：DNA在98 °C下初始变性5 min，随后26个循环，每个循环在98 °C下变性30秒，在53°C下退火30 s，在72°C下延伸45 min，最后在72 °C下终延伸5 min，降温到16 °C保存PCR产物。

致谢

感谢湖南省自然科学基金杰出青年项目 （2024JJ2072）、国家自然科学基金面上基金项目 （42377033）、中南大学研究生自主探索创新项目（No. 2024ZZTS0321）对本工作的大力支持。

参考文献

1. Singh, B. K., Trivedi, P., Egidi, E., Macdonald, C. A. and Delgado-Baquerizo, M. (2020). Crop microbiome and sustainable agriculture. Nat Rev Microbiol. 18(11): 601–602. https://doi.org/10.1038/s41579-020-00446-y
2. Sharma, P. (2021). Efficiency of bacteria and bacterial assisted phytoremediation of heavy metals: An update. Bioresour Technol. 328: 124835. https://doi.org/10.1016/j.biortech.2021.124835
3. Hartmann, M. and Six, J. (2022). Soil structure and microbiome functions in agroecosystems. Nat. Rev. Earth Environ. 4(1): 4–18. https://doi.org/10.1038/s43017-022-00366-w
4. Kaminsky, L. M., Trexler, R. V., Malik, R. J., Hockett, K. L. and Bell, T. H. (2019). The Inherent Conflicts in Developing Soil Microbial Inoculants. Trends Biotechnol. 37(2): 140–151. https://doi.org/10.1016/j.tibtech.2018.11.011
5. Liu, C., Jiang, M., Yuan, M. M., Wang, E., Bai, Y., Crowther, T. W., Zhou, J., Ma, Z., Zhang, L., Wang, Y., et al. (2023). Root microbiota confers rice resistance to aluminium toxicity and phosphorus deficiency in acidic soils. Nat Food. 4(10): 912–924. https://doi.org/10.1038/s43016-023-00848-0
6. Lee, D. J., Show, K. Y. and Wang, A. (2013). Unconventional approaches to isolation and enrichment of functional microbial consortium – A review. Bioresour Technol. 136: 697–706. https://doi.org/10.1016/j.biortech.2013.02.075
7. Zhou, Y., Liu, D., Li, F., Dong, Y., Jin, Z., Liao, Y., Li, X., Peng, S., Delgado-Baquerizo, M., Li, X., et al. (2024). Superiority of native soil core microbiomes in supporting plant growth. Nat Commun. 15(1): 6599. https://doi.org/10.1038/s41467-024-50685-3
8. Niu, B., Paulson, J. N., Zheng, X. and Kolter, R. (2017). Simplified and representative bacterial community of maize roots. Proc Natl Acad Sci USA. 114(12): E2450–E2459. https://doi.org/10.1073/pnas.1616148114
9. Qiao, Y., Wang, Z., Sun, H., Guo, H., Song, Y., Zhang, H., Ruan, Y., Xu, Q., Huang, Q., Shen, Q., et al. (2024). Synthetic community derived from grafted watermelon rhizosphere provides protection for ungrafted watermelon against Fusarium oxysporum via microbial synergistic effects. Microbiome. 12(1): 101. https://doi.org/10.1186/s40168-024-01814-z
10. de Souza, R. S. C., Armanhi, J. S. L., Damasceno, N. d. B., Imperial, J. and Arruda, P. (2019). Genome Sequences of a Plant Beneficial Synthetic Bacterial Community Reveal Genetic Features for Successful Plant Colonization. Front Microbiol. 10: e01779. https://doi.org/10.3389/fmicb.2019.01779

Copyright: © 2024 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC.

引用格式：高寒冰, 何晓, 贾沃, 郭朝晖, 徐锐. (2024). 矿区先锋植物根内生促生菌的高效分离与群落稳定构建. Bio-101: e2405584. DOI: 10.21769/BioProtoc.2405584.
How to cite: Gao, H. B., He, X., Jia, W., Guo, C. H. and Xu, R. (2024). The Efficient Isolation of Growth-Promoting Endophytic Bacteria from Pioneer Plants in Mining Areas and the Stable Construction of Microbial Communities. Bio-101: e2405584. DOI: 10.21769/BioProtoc.2405584.