一、视频摘要
活体激光共聚焦成像系统能够在活体状态下将探头以极低的侵入程度抵达任何器官或深层组织进行显微成像研究，从外周组织、内脏器官到中枢，其以亚微米的高分辨率实时、动态捕捉活体组织和细胞的显微结构、进行细胞和分子事件的监测追踪等[1-2]；可以避免实验过程中处死动物做组织学检测，以及离体切片染色造成的真实原位组织结构破坏和物质成分的流失[3-4]。基于此技术的特色和优势，本视频研究，建立一种小动物活体肝脏组织形态结构成像的操作流程。
二、关键词
探头式活体激光共聚焦成像、活体成像、荧光素钠、肝脏
三、实验样品信息，试剂、耗材或仪器
1. 样品信息
清洁级SD大鼠，雌性，250g，由中国军事医学科学院动物中心提供[许可证：SCXK-
(军)2011-004]。
2. 试剂和耗材
试剂：
（1） 2%的戊巴比妥钠；
（2）
中恒荧光素钠注射液（广西梧州制药）；
（3）异氟烷；
（4）生理盐水；
（6）1% 碘伏消毒液；
（7）75%酒精。
耗材：
（1）1
ml注射器；
（2）1ml胰岛素注射器(BD)；
（3）手术剪；
（4）镊子；
（5）止血钳；
（6）11号手术刀片；
（7）一次性无菌换药盒；
（8）宠物推毛剪。
3. 仪器和软件
（1）小动物活体激光共聚焦成像系统（ViewnVivoB30，OptiScan公司，澳大利亚）；
（2）ImageJ图像分析软件；
（3）自制实验用组织、脏器固定操作平台；
（4）小动物麻醉机。
四、实验操作
（1）打开小动物活体激光共聚焦成像系统的主机和电脑，打开软件连机，调试仪器正常后备用；
（2）大鼠放入小动物麻醉机诱导盒中诱导1min;
(3) 用2%的戊巴比妥钠溶液(30
mg/kg)在大鼠腹腔注射进行麻醉，待大鼠充分麻醉后，将其按仰卧位固定在实验台上；
（4）将20%的荧光素钠注射液稀释为1%浓度，抽取2.5ml稀释后的注射液；用酒精擦拭大鼠尾静脉，将2.5ml注射液注入尾静脉；
（5）将大鼠腹部肋缘以下的毛剃除清扫干净，用碘伏对肋缘下皮肤区域消毒；然后，沿肋缘方向，手术依次切开皮肤、皮下肌肉，切口保持在1.5cm左右，用手将部分肝叶轻轻推挤出切口；
（6）调整组织、脏器固定操作平台的固定装置，将暴露在体表的肝叶无创固定，保证肝叶不受动物呼吸心跳影响出现移动；
（7）将成像系统光纤探头垂直放置在肝叶观察窗口，调节激光功率、扫描深度、白平衡，使成像视野组织结构清晰，按软件操作步骤存贮图像文件；移动光纤探头位置，观察采集不同区域的组织成像图像；同时，可以设置某个感兴趣区域组织进行3D成像扫描。
（8）用ImageJ图像分析软件对存贮的图像进行分析；
（9）实验观察结束后，用2%戊巴比妥钠溶液过量腹腔注射（2ml）处死大鼠，并进行无害化处理。
五、注意事项
（1）操作过程中不能暴力拉拽光纤探头；
（2）手术创口尽量较小，避免出血过多对成像视野的污染；
（3）观察过程中，常用75%酒精棉或镜头纸擦拭探头镜头，用无菌棉球轻轻擦拭肝脏表面液体，保持镜头无污染；
（4）保证动物在深度麻醉状态，不会对图像观察采集造成干扰；
（5）实现活体肝脏的稳定固定，避免呼吸心跳对成像的扰动。
六、参考文献
[1]
Kossatz S, Pirovano G, Demétrio De Souza França P, et al.
Validation of the use of a fluorescent PARP1 inhibitor for the
detection of oral, oropharyngeal and oesophageal epithelial cancers.
Nature Biomedical Engineering. 2020;4(3):272-85. doi:
10.1038/s41551-020-0526-9.
[2]
Watermann, A., Gieringer, R., Bauer, A.-M., et al. Fluorescein- and
EGFR-Antibody Conjugated Silica Nanoparticles for Enhancement of
Real-time Tumor Border Definition Using Confocal Laser Endomicroscopy
in Squamous Cell Carcinoma of the Head and Neck. Nanomaterials,
9(10).
[3] 宋晓晶，熊枫，贾术永，王广军，王淑友，王瑾玉，张维波.大鼠腹内壁中线间质通道微观结构的活体激光共聚焦成像观察.激光生物学报，2021;30(5):469-474.
[4] 宋晓晶, 张维波, 贾术永, 等. 应用小动物活体激光共聚焦成像系统对大鼠腹壁循经组织组织液分布的初步观察[J]. 中国中医基础医学杂志,
2020, 27(4): 474-478.
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