NMY51膜系统酵母感受态制备及转化

一、视频摘要

酵母双杂交是验证蛋白互作的一个重要方法，通过诱饵蛋白与泛素Cub融合于BD载体，猎物蛋白与泛素Nub融台于AD载体,转入NMY51菌株后，只有蛋白相互作用,泛素才能完整结合,进而被UBPs识别剪切,剪切下来的LexA-VP16 (人工转录因子)进入细胞核,激活下游报告基因表达。NMY51膜系统酵母双杂交为定位在膜上的蛋白提供了解决办法。

二、关键词

膜系统酵母双杂、NMY51、DUAL membrane系统

三、实验样品信息，试剂、耗材或仪器

1. 样品信息

2. 试剂和耗材

试剂：YPDA培养基、1M LiAC、10X TE buffer、50% PEG、0.9% NaCl、Single-stranded carrier DNA、3-AT、DMSO、NMY51酵母菌株、SD/-Leu固体培养基等、质粒等（具体参见视频）。

耗材：灭菌枪头、移液枪、离心管、比色皿、酒精灯、酒精喷壶、双面板、冰盒、离心管架、酵母封口膜。

3. 仪器和软件

恒温摇床、离心机、超净工作台

四、实验操作

1. 挑取NMY51单斑于YPDA培养基中，30℃ 220rpm过夜一摇；

2. 吸取一摇菌液于新的YPDA培养基中，30℃ 220rpm摇至OD546=0.6-0.8；

3. 2500g 5min收集菌体；

4. 2.5ml ddH2O重悬菌体；

5. 准备PEG/LiOAc master mix；

6. 每个反应添加各1.5 ug的AD和BD质粒；

7. 每个反应添加300ul PEG/ LiOAc混液混匀；

8. 每个反应添加100ul重悬细胞，混匀；

9. 42℃，水浴45min；

10. 700g 5min；

11. 弃上清，NaCl重悬涂板。

五、注意事项

注意药品配制过程，防止污染。