一、视频摘要
酵母双杂交是验证蛋白互作的一个重要方法,通过诱饵蛋白与泛素Cub融合于BD载体,猎物蛋白与泛素Nub融台于AD载体,转入NMY51菌株后,只有蛋白相互作用,泛素才能完整结合,进而被UBPs识别剪切,剪切下来的LexA-VP16
(人工转录因子)进入细胞核,激活下游报告基因表达。NMY51膜系统酵母双杂交为定位在膜上的蛋白提供了解决办法。
二、关键词
膜系统酵母双杂、NMY51、DUAL
membrane系统
三、实验样品信息,试剂、耗材或仪器
1. 样品信息
2. 试剂和耗材
试剂:YPDA培养基、1M
LiAC、10X
TE buffer、50%
PEG、0.9%
NaCl、Single-stranded
carrier DNA、3-AT、DMSO、NMY51酵母菌株、SD/-Leu固体培养基等、质粒等(具体参见视频)。
耗材:灭菌枪头、移液枪、离心管、比色皿、酒精灯、酒精喷壶、双面板、冰盒、离心管架、酵母封口膜。
3. 仪器和软件
恒温摇床、离心机、超净工作台
四、实验操作
1. 挑取NMY51单斑于YPDA培养基中,30℃
220rpm过夜一摇;
2. 吸取一摇菌液于新的YPDA培养基中,30℃
220rpm摇至OD546=0.6-0.8;
3.
2500g 5min收集菌体;
4.
2.5ml ddH2O重悬菌体;
5. 准备PEG/LiOAc
master mix;
6. 每个反应添加各1.5
ug的AD和BD质粒;
7. 每个反应添加300ul
PEG/ LiOAc混液混匀;
8. 每个反应添加100ul重悬细胞,混匀;
9.
42℃,水浴45min;
10.
700g 5min;
11. 弃上清,NaCl重悬涂板。
五、注意事项
注意药品配制过程,防止污染。
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