昆虫显微注射方法——以稻飞虱为例

一、视频摘要

显微注射方法是在高倍倒置显微镜下，利用显微操作器，控制显微注射针在显微镜视野内移动的机械装置，用来进行细胞或早期胚胎操作的一种方法。本视频以小型昆虫稻飞虱为例，应用显微注射方法，将dsRNA递送至昆虫体腔，以达到基因沉默的目的。该方法在昆虫基因研究中应用广泛。

二、关键词

稻飞虱，显微注射，CO₂气瓶使用

三、实验样品信息，试剂、耗材或仪器

1. 样品信息

稻飞虱若虫

2. 试剂和耗材

50ml离心管、WPI玻璃毛细管、眼科显微剪刀、装有液体石蜡的注射器、2%琼脂板、0号毛笔、装有新鲜水稻苗的一次性透明塑料杯WPI注射针、吸虫器、水稻苗、显微镜、注射器、二氧化碳气瓶（麻醉）

3. 仪器和软件

显微操作仪器：Nanoject 4 micoinjection device (MicroSyringe Pump Controller; World Precision Instruments, USA)

四、实验操作

（1）剪针，将拉好的毛细玻璃管柔软尖端剪掉，保留合适硬度的针尖。装液体石蜡，用注射器将液体石蜡推进、装满玻璃针管。装针，首先旋下泵头套，将玻璃针的尾端从泵头套前端装入，然后，将3个垫圈按照“黑白黑”的方式，依次将大孔径黑垫圈套进玻璃针尾部，小孔径黑色垫圈套进注射泵钢针，白色垫圈小孔径朝向钢针，套在钢针上。最后，将玻璃针尾部朝向钢针，将钢针插入玻璃针，用纸巾吸走溢出的液体石蜡。缓慢推进泵头套和玻璃针，将泵头套连同玻璃针安装在注射泵上。

（2）仪器设置，打开显微注射泵，进行系统设置。选择远程控制，即使用脚踏板控制。选择钢针方向，设置为推出模式。单击脚踏板，注射泵将钢针排出，推出大约1/3液体石蜡。

（3）吸取dsRNA，如dsRNA等需要注射进入试虫体内的试剂。吸入体积约是排出液体石蜡的体积。吸入的液体与液体石蜡有明显分层。

（4）麻醉试虫，使用二氧化碳熏虫，约30s。

（5）显微注射，使用体视镜，2倍放大。将玻璃针尖插入试虫胸部前胸和中胸或者中胸和后胸的中间位置，单击脚踏板，完成注射。注射完成后，用0号毛笔将试虫推离玻璃针，放置在琼脂板的另一边。随后，通过移动琼脂板，在显微镜视野中进行下一头试虫的注射。直至完成琼脂板上所有试虫的注射，用吸虫器将试虫转移进50ml离心管，等待试虫苏醒。

（6）卸针，完成注射后，旋高注射泵，移走琼脂板。缓慢拧下泵头套，拿下玻璃针。用玻璃针尾部挤推出3个垫圈，并归位。将使用完的玻璃针丢弃在玻璃垃圾桶中。然后，将泵头套复位。最后，收回钢针。

（7）关机，关闭体视镜光源，关闭显微操作泵操作器。关闭二氧化碳气瓶，先关闭主阀，放出气管中剩余气体，气压为0后，关闭分阀，关闭操作阀。

（8）转移试虫，试虫苏醒后，将试虫转移至新鲜水稻苗上饲养。以备下一步实验。完成显微注射。

五、注意事项

1. 每次使用二氧化碳麻醉稻飞虱若虫数量不宜过多，15-20头为宜。

2. 稻飞虱若虫接受二氧化碳麻醉不宜超过2次。
   

六、结果分析（可选）

七、参考文献（可选）

Liu, S.H., Ding, Z.P., Zhang, C.W., Yang, B.J., and Liu, Z.W. (2010). Gene knockdown by intro-thoracic injection of double-stranded RNA in the brown planthopper, Nilaparvata lugens. Insect Biochem Molec 40, 666-671.