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昆虫显微注射方法——以稻飞虱为例

张慧慧 |  2022-11-23  | DOI: 10.21769/BioProtoc.v1017
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视频简介显微注射方法是在高倍倒置显微镜下,利用显微操作器,控制显微注射针在显微镜视野内移动的机械装置,用来进行细胞或早期胚胎操作的一种方法。本视频以小型昆虫稻飞虱为例,应用显微注射方法,将dsRNA递送至昆虫体腔,以达到基因沉默的目的。该方法在昆虫基因研究中应用广泛。
  • 视频介绍

一、视频摘要

显微注射方法是在高倍倒置显微镜下,利用显微操作器,控制显微注射针在显微镜视野内移动的机械装置,用来进行细胞或早期胚胎操作的一种方法。本视频以小型昆虫稻飞虱为例,应用显微注射方法,将dsRNA递送至昆虫体腔,以达到基因沉默的目的。该方法在昆虫基因研究中应用广泛。


二、关键词

稻飞虱,显微注射,CO2气瓶使用


三、实验样品信息,试剂、耗材或仪器

1. 样品信息

稻飞虱若虫


2. 试剂和耗材

50ml离心管、WPI玻璃毛细管、眼科显微剪刀、装有液体石蜡的注射器、2%琼脂板、0号毛笔、装有新鲜水稻苗的一次性透明塑料杯WPI注射针、吸虫器、水稻苗、显微镜、注射器、二氧化碳气瓶(麻醉)


3. 仪器和软件

显微操作仪器:Nanoject 4 micoinjection device (MicroSyringe Pump Controller; World Precision Instruments, USA)


四、实验操作

1)剪针,将拉好的毛细玻璃管柔软尖端剪掉,保留合适硬度的针尖。装液体石蜡,用注射器将液体石蜡推进、装满玻璃针管。装针,首先旋下泵头套,将玻璃针的尾端从泵头套前端装入,然后,将3个垫圈按照“黑白黑”的方式,依次将大孔径黑垫圈套进玻璃针尾部,小孔径黑色垫圈套进注射泵钢针,白色垫圈小孔径朝向钢针,套在钢针上。最后,将玻璃针尾部朝向钢针,将钢针插入玻璃针,用纸巾吸走溢出的液体石蜡。缓慢推进泵头套和玻璃针,将泵头套连同玻璃针安装在注射泵上。

2)仪器设置,打开显微注射泵,进行系统设置。选择远程控制,即使用脚踏板控制。选择钢针方向,设置为推出模式。单击脚踏板,注射泵将钢针排出,推出大约1/3液体石蜡。

3)吸取dsRNA,如dsRNA等需要注射进入试虫体内的试剂。吸入体积约是排出液体石蜡的体积。吸入的液体与液体石蜡有明显分层。

4)麻醉试虫,使用二氧化碳熏虫,约30s

5)显微注射,使用体视镜,2倍放大。将玻璃针尖插入试虫胸部前胸和中胸或者中胸和后胸的中间位置,单击脚踏板,完成注射。注射完成后,用0号毛笔将试虫推离玻璃针,放置在琼脂板的另一边。随后,通过移动琼脂板,在显微镜视野中进行下一头试虫的注射。直至完成琼脂板上所有试虫的注射,用吸虫器将试虫转移进50ml离心管,等待试虫苏醒。

6)卸针,完成注射后,旋高注射泵,移走琼脂板。缓慢拧下泵头套,拿下玻璃针。用玻璃针尾部挤推出3个垫圈,并归位。将使用完的玻璃针丢弃在玻璃垃圾桶中。然后,将泵头套复位。最后,收回钢针。

7)关机,关闭体视镜光源,关闭显微操作泵操作器。关闭二氧化碳气瓶,先关闭主阀,放出气管中剩余气体,气压为0后,关闭分阀,关闭操作阀。

8)转移试虫,试虫苏醒后,将试虫转移至新鲜水稻苗上饲养。以备下一步实验。完成显微注射。

五、注意事项

  1. 每次使用二氧化碳麻醉稻飞虱若虫数量不宜过多,15-20头为宜。

  2. 稻飞虱若虫接受二氧化碳麻醉不宜超过2次。

六、结果分析(可选)


七、参考文献(可选)

Liu, S.H., Ding, Z.P., Zhang, C.W., Yang, B.J., and Liu, Z.W. (2010). Gene knockdown by intro-thoracic injection of double-stranded RNA in the brown planthopper, Nilaparvata lugens. Insect Biochem Molec 40, 666-671.

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