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镍亲和层析介质的再生

王超 |  2022-11-23  | DOI: 10.21769/BioProtoc.v1021
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视频简介镍介质(Ni-NTA Resin)是蛋白纯化实验中常用于亲和层析的材料,它能够与带(His)6标签的蛋白结合从而提取蛋白,再由咪唑溶液将蛋白竞争洗脱,用于后续纯化。在经过多次实验后,介质中残留的蛋白以及镍的流失会导致介质的蛋白结合能力和特异性逐渐下降。此时对镍介质进行再生是一个方便快捷以提高结合效率的方法。
  • 视频介绍

一、视频摘要

实验原理

镍介质(Ni-NTA Resin)是蛋白纯化实验中常用于亲和层析的材料,它能够与带(His)6标签的蛋白结合从而提取蛋白,再由咪唑溶液将蛋白竞争洗脱,用于后续纯化。而通过梯度乙醇可以除去介质(Beads)中残留的脂类、去垢剂和疏水互作杂蛋白;用盐酸胍可以去除介质上残留的变性蛋白沉淀,而EDTA螯合加重结合的方法可以将介质上的镍进行卸载和重安装,增加介质的结合能力。

实验目的:

在经过多次实验后,介质中残留的蛋白以及镍的流失会导致介质的蛋白结合能力和特异性逐渐下降。此时对镍介质进行再生是一个方便快捷以提高结合效率的方法。

实验结果:

通过对镍亲和介质的重生实验,可以明显改善老旧介质结合目的蛋白的能力。


二、关键词

镍介质,His-tag,亲和层析


三、实验样品信息,试剂、耗材或仪器

1. 样品信息

结合能力下降的老旧镍亲和层析介质。

2. 试剂和耗材

(以再生50 mL镍介质为例)

  1. 纯水 1 L

  2. 洁净重力柱 1-2

  3. 6 M 盐酸胍 200 mL

  4. 25%/50%/75%(v/v) 乙醇 50 mL

  5. 0.1 M 硫酸镍 200 mL

  6. 0.1 M EDTA pH 6.0 200 mL

  7. 保存溶液(20%乙醇 in PBS 100 mL

所有溶液宜使用0.45 μm PVDF膜过滤

3. 仪器和软件

  1. 干净的空重力柱及柱架

  2. 旋转混匀仪

四、实验操作

  1. 2CV 纯水过柱

  2. 1CV 25% 乙醇—1CV 50% 乙醇—2CV 75% 乙醇—1CV 50% 乙醇—1CV 25% 乙醇
    梯度乙醇去除残留的脂类、去垢剂和疏水互作杂蛋白

  3. 2CV 纯水

  4. 5CV 0.1 M EDTA
    螯合介质颗粒上的镍,除去金属结合杂质

  5. 2CV 纯水

  6. 2CV 6M 盐酸胍
    盐酸胍去除变性沉淀的蛋白

  7. 5CV 纯水

  8. 2CV 0.1 M 硫酸镍,孵育10分钟
    镍重结合到介质上

  9. 2CV 保存溶液

五、注意事项

  1. 镍亲和介质保存环境的温度建议为4度,不可放于零下环境冷冻。需要始终处于液体环境中,不可风干。

  2. 重组目的蛋白的产量和纯度取决于蛋白的构象、溶解度和表达水平等。若介质结合情况异常,应当优化并执行小规模的制备,以估计表达和溶解度水平,排除蛋白本身的干扰。

  3. 在亲和实验中应当避免含有EDTA的蛋白酶抑制剂,因为EDTA会不可逆影响介质结合能力。


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