一、视频摘要
可利用农杆菌介导外源基因瞬时转化烟草叶片,借此进行蛋白质的亚细胞定位、蛋白质-DNA互作(如双荧光素酶实验)、蛋白-蛋白互作(如BiFC)和蛋白质的纯化等实验操作。
二、关键词
烟草 瞬时转化
浸润 农杆菌
三、实验样品信息,试剂、耗材或仪器
1. 样品信息
(1)烟草(Nicotiana
tabacum L.)
(2)已转入带有目的基因的载体的农杆菌
2. 试剂和耗材
试剂:
(1)50mg/mL Rif(5mL母液):称取250mg
Rif溶于ddH2O并定容至5mL,用滤膜过滤除菌后分装至1.5mL的离心管中备用。
(2)加有相应抗生素和Rif的YEB液体培养基,用于摇菌。
(3)1M
MES-KOH(100mL):称取21.325g
MES溶于100mL ddH2O,用KOH溶液调pH至5.6-5.7,保存于4℃备用。
(4)2M
MgCl2(100mL):称取40.66g MgCl2溶于100mL ddH2O,保存于4℃备用。
(5)AS-Medium(100mL)(现用现配):取1mL 2M MES-KOH(5.6-5.7)、499.5μL 2M MgCl2、100μL 150mM As、98.5ml
dH2O混匀备用。
(6)150mM乙酰丁香酮(5mL):称取0.14715g乙酰丁香酮溶于DMSO并定容至5mL,用滤膜过滤灭菌后分装,保存于-20℃备用。
耗材:
(1)1mL注射器
(2)0.22μm滤器
(3)1.5mL、15mL和50mL离心管
(4)9*9cm培养皿
3. 仪器和软件
(1)离心机
(2)恒温摇床
(3)恒温培养箱
(4)分光光度计
四、实验操作
1.将转化了表达载体的农杆菌接种于含Rif和相应抗生素的YEB固体培养基,28℃培养。
2.鉴定阳性菌落并接种于5mL含Rif和相应抗生素的YEB液体培养基中,28°C培养一夜。给2-4周龄的烟草幼苗浇水(适量),罩上透明盖子以使气孔打开。
3.取1mL过夜培养物,接种于5mL新鲜的含Rif和相应抗生素的YEB液体培养基中,28°C培养1-2小时(OD6001.8~2.0/1.2~2.2)。
4.根据1/OD600值计算1mL OD600为0.5的菌所需农杆菌的量,于2mL离心管中离心(4000g,15min,4℃),弃上清,用1mL As-Medium重悬菌体,室温孵育1h~2h。
5.渗透:挑选较年轻的叶,一手按着叶片上面,另一只手使用注射器(去掉针头)对着叶片背部的待侵染区域轻轻推动活塞,直到看到液体扩散,再侵染其他部位。侵染完成后,用记号笔圈定侵染区域。
6.将侵染后的烟草放回到培养室,罩上有孔的透明盖子(减少蒸腾作用)在温室中放置一夜,第二天早上将植物避光培养。
7.侵染后2-3天可以取样进行后续实验。
五、注意事项
1.过夜培养物的OD值不宜太高以保持菌的活力。
2.植株的状态影响外源基因的表达,所以应选择健康、处于壮年的烟草叶片进行注射。
3.烟草叶片的注射范围不宜过大,否则会影响烟草的正常生长。
4.要注意侵染后烟草的生长状态,及时补充水分。
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