烟草叶片瞬时转化实验

一、视频摘要

可利用农杆菌介导外源基因瞬时转化烟草叶片，借此进行蛋白质的亚细胞定位、蛋白质-DNA互作（如双荧光素酶实验）、蛋白-蛋白互作（如BiFC）和蛋白质的纯化等实验操作。

二、关键词

烟草 瞬时转化 浸润 农杆菌

三、实验样品信息，试剂、耗材或仪器

1. 样品信息

（1）烟草(Nicotiana tabacum L.)

（2）已转入带有目的基因的载体的农杆菌

2. 试剂和耗材

试剂:

（1）50mg/mL Rif（5mL母液）：称取250mg Rif溶于ddH₂O并定容至5mL，用滤膜过滤除菌后分装至1.5mL的离心管中备用。

（2）加有相应抗生素和Rif的YEB液体培养基，用于摇菌。

（3）1M MES-KOH（100mL）：称取21.325g MES溶于100mL ddH₂O，用KOH溶液调pH至5.6-5.7，保存于4℃备用。

（4）2M MgCl₂（100mL）：称取40.66g MgCl₂溶于100mL ddH₂O，保存于4℃备用。

（5）AS-Medium（100mL）（现用现配）：取1mL 2M MES-KOH(5.6-5.7)、499.5μL 2M MgCl2、100μL 150mM As、98.5ml dH₂O混匀备用。

（6）150mM乙酰丁香酮(5mL)：称取0.14715g乙酰丁香酮溶于DMSO并定容至5mL，用滤膜过滤灭菌后分装，保存于-20℃备用。

耗材：

（1）1mL注射器
（2）0.22μm滤器

（3）1.5mL、15mL和50mL离心管

（4）9*9cm培养皿

3. 仪器和软件

（1）离心机

（2）恒温摇床

（3）恒温培养箱

（4）分光光度计

四、实验操作

1.将转化了表达载体的农杆菌接种于含Rif和相应抗生素的YEB固体培养基，28℃培养。

2.鉴定阳性菌落并接种于5mL含Rif和相应抗生素的YEB液体培养基中，28°C培养一夜。给2-4周龄的烟草幼苗浇水（适量），罩上透明盖子以使气孔打开。

3.取1mL过夜培养物，接种于5mL新鲜的含Rif和相应抗生素的YEB液体培养基中，28°C培养1-2小时（OD₆₀₀1.8~2.0/1.2~2.2）。

4.根据1/OD₆₀₀值计算1mL OD₆₀₀为0.5的菌所需农杆菌的量，于2mL离心管中离心(4000g，15min，4℃)，弃上清，用1mL As-Medium重悬菌体，室温孵育1h~2h。

5.渗透：挑选较年轻的叶，一手按着叶片上面，另一只手使用注射器（去掉针头）对着叶片背部的待侵染区域轻轻推动活塞，直到看到液体扩散，再侵染其他部位。侵染完成后，用记号笔圈定侵染区域。

6.将侵染后的烟草放回到培养室，罩上有孔的透明盖子（减少蒸腾作用）在温室中放置一夜，第二天早上将植物避光培养。

7.侵染后2-3天可以取样进行后续实验。

五、注意事项

1.过夜培养物的OD值不宜太高以保持菌的活力。

2.植株的状态影响外源基因的表达，所以应选择健康、处于壮年的烟草叶片进行注射。

3.烟草叶片的注射范围不宜过大，否则会影响烟草的正常生长。

4.要注意侵染后烟草的生长状态，及时补充水分。