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烟草叶片瞬时转化实验

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视频简介烟草叶片瞬时转化实验目的是利用农杆菌将外源基因导入到烟草叶片中进行表达,借此可以进行蛋白的亚细胞定位、转录活性鉴定、蛋白互作和蛋白的纯化等实验操作,对生物研究的进行具有非常重要的意义。因此,本视频基于前辈们的研究,展示了农杆菌侵染烟草叶片表皮实验过程,以帮助同学们规范操作,提高烟草叶片的瞬时转化效率,为大家的实验带来帮助。
  • 视频介绍

一、视频摘要

利用农杆菌介导外源基因瞬时转化烟草叶片,借此进行蛋白的亚细胞定位、-DNA互作双荧光素酶实验)、蛋白-蛋白互作(BiFC)和蛋白的纯化等实验操作。

二、关键词

烟草 瞬时转化 浸润 农杆菌

三、实验样品信息,试剂、耗材或仪器

1. 样品信息

1烟草(Nicotiana tabacum L.)

2已转入带目的基因的载体的农杆菌

2. 试剂和耗材

试剂:

150mg/mL Rif5mL母液:称250mg Rif溶于ddH2O定容至5mL,用滤膜过滤除菌分装至1.5mL的离心管中备用

2加有相应抗生素和RifYEB液体培养基,用于摇菌

31M MES-KOH100mL):称取21.325g MES溶于100mL ddH2OKOH溶液pH5.6-5.7,保存于4℃备用

42M MgCl2100mL称取40.66g MgCl2溶于100mL ddH2O,保存于4℃备用

5AS-Medium100mL)(现用现配1mL 2M MES-KOH(5.6-5.7)499.5μL 2M MgCl2100μL 150mM As98.5ml dH2O混匀备用

6150mM乙酰丁香酮(5mL)称取0.14715g乙酰丁香酮溶于DMSO定容至5mL,用滤膜过滤灭菌后分装存于-20℃备用

耗材

11mL注射器
20.22μm滤器

31.5mL15mL50mL离心管

49*9cm培养

3. 仪器和软件

1离心机

2恒温摇床

3恒温培养箱

4分光光度计

四、实验操作

1.将转化了表达载体的农杆菌接种于Rif和相应抗生素的YEB固体培养基,28℃培养

2.鉴定阳性菌落并接种于5mLRif和相应抗生素的YEB液体培养基中,28°C培养一夜。给2-4周龄的烟草幼苗浇水适量罩上透明盖子使气孔打开。

3.1mL过夜培养物,接种于5mL新鲜的Rif和相应抗生素YEB液体培养基中,28°C培养1-2小时(OD6001.8~2.0/1.2~2.2)。

4.根据1/OD600值计算1mL OD6000.5的菌所需农杆菌的量,2mL离心管中离心(4000g15min4℃),弃上清,用1mL As-Medium重悬菌体室温孵育1h~2h

5.渗透挑选较年轻的叶一手按着叶片上面,另一只手使用注射器去掉针头对着叶片背部的待侵染区域轻轻推动活塞,直到看到液体扩散,再侵染其他部位侵染完成后,用记号笔圈定侵染区域

6.将侵染后的烟草放回到培养室,罩上有孔的透明盖子(减少蒸腾作用)在温室中放置一夜,第二天早上将植物避光培养。

7.侵染后2-3天可以取样进行后续实验

五、注意事项

1.过夜培养物的OD值不宜太高保持菌的活力

2.植株的状态影响外源基因的表达,所以应选择健康、处于壮年的烟草叶片进行注射

3.烟草叶片的注射范围不宜过大,否则会影响烟草的正常生长

4.要注意侵染后烟草的生长状态,及时补充水分。

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