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酶联免疫吸附实验(ELISA)操作演示

何道宏 |  2022-11-23  | DOI: 10.21769/BioProtoc.v1031
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视频简介ELISA因其敏感性高,特异性强等特点,被广泛用于临床或科研中。ELISA实验操作相对简单,但细节稍不注意,很容易产生假阳性或假阴性。ELISA的原理是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性,酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性,又保留酶的活性。在测定时,标本与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与液体中的其他物质分开。再加入酶标记的抗原或抗体,通过反应而结合在固相载体上。固相上的酶量与样本中受检物质的量呈比例。加入酶反应的底物后,底物被酶催化成为有色产物,产物的量与样本中受检物质的量相关,因此,可根据反应颜色的深浅进行定性或定量分析。
  • 视频介绍

一、视频摘要

ELISA因其敏感性高,特异性强等特点,被广泛用于临床或科研中。ELISA实验操作相对简单,但细节稍不注意,很容易产生假阳性或假阴性。ELISA的原理是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性,酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性,又保留酶的活性。在测定时,标本与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与液体中的其他物质分开。再加入酶标记的抗原或抗体,通过反应而结合在固相载体上。固相上的酶量与样本中受检物质的量呈比例。加入酶反应的底物后,底物被酶催化成为有色产物,产物的量与样本中受检物质的量相关,因此,可根据反应颜色的深浅进行定性或定量分析。


二、关键词

Elisa、酶联免疫吸附、夹心法


三、实验样品信息,试剂、耗材或仪器

1. 样品信息

小鼠血清


2. 试剂和耗材

试剂:

冻干标准品、浓缩生物素化抗体(100×)、浓缩HRP酶结合物(100×)、样品&标准品稀释液、生物素化抗体稀释液、酶结合物稀释液、浓缩洗涤液(20×)、底物溶液(TMB)、反应终止液

耗材:

移液器、酶标包被板、封板膜、密封袋、EP


3. 仪器和软件

仪器:

BioTek Eon型酶标仪、恒温箱、洗板机

软件:

Origin


四、实验操作

1.从室温平衡10分钟后的铝箔袋中取出所需板条,剩余板条用自封袋密封放回4°C

2.加样:分别将样品或不同浓度标准品按照100μL 每孔加入相应孔中,空白孔加入100μL通用稀释液。盖上封板膜后37°C温育1小时。

3.加生物素化抗体:取出酶标板,弃去液体,不用洗涤。每孔直接加入生物素化抗体工作液100μL,盖上封板膜后37°C温育 1 小时。

4.洗板:奔去液体,每孔加入 300μL 1x洗涤液,静置 1分钟,甩去洗涤液,吸水纸上拍干,如此重复洗板3次。

5.加酶结合物工作液:每孔加入酶结合物工作液100μL,盖上封板膜后37°C温育30分钟。

6.洗板:弃去液体按步骤4 洗涤方法,洗板 5 次。

7.加底物:每孔加入底物(TMB90μL,盖上封板膜,37℃避光温育15分钟。

8.加终止液:取出爾标板,每孔直接加入终止液50μL,立即在450nm波长处测定各孔的OD值。


五、注意事项

1.生物素化抗体与酶结合物,使用前15分钟用1000×g离心1分钟

2.生物素化检抗工作液在使用前15分钟内配制好

3.每次都需要使用新的封板膜进行温育,避免交叉污染

4.加终止液时枪头应在液面上方,避免交叉污染

5.加液速度不宜太慢,防止出现假阳性

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