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农杆菌的瞬时侵染实验

张道顺 |  2022-11-23  | DOI: 10.21769/BioProtoc.v1032
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视频简介该实验讲述如何利用把已将重组质粒转入的农杆菌来侵染本氏烟草叶片,从而获得目的基因瞬时表达的烟草。我们之后可以利用烟草的瞬时表达系统来观察感兴趣蛋白的亚细胞定位(通过与红色荧光蛋白构成融合蛋白)。同时,还可以检测蛋白的表达量。这一个过程是通过农杆菌作为一个工具将目的基因整合到到烟草的细胞内的。
  • 视频介绍

 一、视频摘要

利用烟草的瞬时表达系统来观察感兴趣蛋白的亚细胞定位(通过与色荧光蛋白构成融合蛋白)。这一个过程是通过农杆菌作为一个工具将目的基因整合到到烟草的细胞内的



二、关键词

农杆菌侵染 瞬时表达 荧光蛋白

三、
实验样品信息,试剂、耗材或仪器

1. 样品信息

Gate100-RFP表达载体、农杆菌GV3101

2. 试剂和耗材

离心管、1mL注射器、枪头、移液器、酒精灯、1M 氯化镁、1M MESAS、无菌水。

3. 仪器和软件

恒温培养箱、摇床、超净工作台、植物培养温室、微量紫外分光光度计。

四、实验操作

1.挑取单克隆(或保存的菌株)于5 ml LB液体培养中,28~30°C震荡培养。LB中加入50ug/ml 利福平(农杆菌株GV3101携带抗性),50 ug/ml 卡纳霉素(载体携带)。

2. 将过夜培养的农杆菌5000rpm 15min离心收集菌体,重悬液重悬(重悬液配方:1M氯化镁2mL,1M MES 2mLAS200μL,无菌水定容至200mL)。

3. 检测重悬的的菌液OD600≈0.5

4. 室温放置2~3 h后注射烟草。:将侵染液装入1 ml 注射器内,用拇指按压注射器反板将液体从叶片下表皮注射到烟草叶片内(勿使用子叶)。注射后,烟草叶片会出现湿润的现象。

5. 注射后2~5天,在便携式长波长紫外灯下检测GFP荧光信号(只适用于荧光很强的叶片)或通过激光共聚交荧光显微镜检测RFP信号


五、注意事项

注意无菌操作,避免污染

择选取生长状态良好,健壮的烟草叶片植株尤为重要(本氏烟苗应四周大小,茁壮且完全展开的年轻苗株),转化前苗需浇水浇透,注射前光照1h气孔打开。


六、结果分析(可选)

RFP表达在烟草细胞的细胞质内,表达充分,荧光强度高,可满足下一步实验要求。


七、参考文献(可选)

[1]Zhang Daoshun,Song Liyun,Lin Zhonglong,Huang Kun,Liu Chunming,Wang Yong,Liu Dongyang,Zhang Songbai,Yang Jinguang. HACC-Based Nanoscale Delivery of the NbMLP28 Plasmid as a Crop Protection Strategy for Viral Diseases.[J]. ACS omega,2021,6(49).

[2]张悦婧,李颖,王娟娟,庞海龙,贾凌云,冯汉青.不同转化条件对3种农杆菌GFP基因在本氏烟草中瞬时表达的影响[J].植物研究,2022,42(01):121-129.

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