一、视频摘要
基因克隆或分子克隆，又称为重组DNA技术，是应用酶学方法，在体外将不同来源的DNA分子通过酶切、连接等操作重新组装成杂合分子，并使之在适当的宿主细胞中进行扩增，形成大量的子代DNA分子的过程。本实验通以cDNA为模板，通过PCR扩增CDS序列，以便于后续克隆或表达载体的构建。
二、关键词
基因克隆，DNA重组，PCR
三、实验样品信息，试剂、耗材或仪器
一、样品信息
cDNA
二、试剂和耗材
1. 模板cDNA、Phanta
Max Super-Fidelity DNA Polymerase、dNTP、ddH20、2xPhanta
Max Buffer、正向/反向引物
2. 琼脂糖、电泳缓冲液、核酸染料EB
三、仪器和软件
PCR仪、凝胶成像仪
四、实验操作
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组分
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体积
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ddH2O
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up
to 50 μL
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2
× Phanta Max Buffera
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25
μL
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dNTP
Mix(10 mM each)
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1
μL
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上游引物(10
μM)
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2
μL
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下游引物(10
μM)
|
2
μL
|
|
Phanta
Max Super-Fidelity DNA Polymerase
|
1
μL
|
|
模板DNA
|
x
μL
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五、注意事项
1. 戴一次性手套，若不小心溅上反应液，立即更换手套；
2. 使用一次性吸头，严禁与PCR产物分析室的吸头混用，吸头不要长时间暴露于空气中，避免气溶胶的污染；
3. 避免反应液飞溅，打开反应管时为避免此种情况，开盖前稍离心收集液体于管底。若不小心溅到手套或桌面上，应立刻更换手套并用稀酸擦拭桌面；
4. 操作多份样品时，制备反应混合液，先将dNTP、缓冲液、引物和酶混合好，然后分装，这样即可以减少操作，避免污染，又可以增加反应的精确度；
5. 最后加入反应模板，加入后盖紧反应管；
6. 操作时设立阴阳性对照和空白对照，即可验证PCR反应的可靠性，又可以协助判断扩增系统的可信性；
7. 尽可能用可替换或可高压处理的加样器，由于加样器最容易受产物气溶胶或标本DNA的污染，最好使用可替换或高压处理的加样器。如没有这种特殊的加样器，至少PCR操作过程中加样器应该专用，不能交叉使用，尤其是PCR产物分析所用加样器不能拿到其它两个区；
六、结果分析（可选）
七、参考文献（可选）
戚金亮,马小娟,王丽,印莉萍,韩振海. 常规 PCR 与 RACE 结合法快
速从 cDNA 文库中克隆基因[J]. 首都师范大学学报(自然科学版).2004(01)
陈启军,李德昌. 基因克隆的几种常用方法[J]. 中国兽医学报.1999(01)
阮庆国,付俊江. 克隆基因的策略[J]. 国外医学(分子生物学分册).1996(01)
连争,赵建滨,王惠珍,张悦红,刘德文. 克隆基因的新方法[J]. 山西医科大学学报.
1998(04)
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