一、视频摘要
Real
Time
PCR，即实时荧光定量PCR，也被称为定量PCR或qPCR，是实时监测PCR扩增产物并进行解析的方法。一般进行定量PCR的目的，是为了进行mRNA的表达量分析，或者对RNA拷贝数进行定量，或者确定RNA病毒是否存在的定性分析，那么首先都需要进行反转录实验，将RNA反转录为cDNA。
二、关键词
RNA 反转录
定量
三、实验样品信息，试剂、耗材或仪器
1. 样品信息
高质量RNA提取试剂盒（货号K0731）
DNase（货号EN0771/EN0521）。
RevertAid
Master Mix （货号M1631/M1632）
2. 试剂和耗材
移液枪 枪头 dna模板
反转录酶
3. 仪器和软件
PCR仪
定量分析仪器 离心机
四、实验操作
（1）细胞或组织加入Trizol后，室温放置5min使其充分裂解，这会让核酸蛋白复合物完全分离（可轻轻翻转离心管混匀）。
注意！ 此时可放入-70℃长期保存。
（2）12000rpm，4℃，10min，后取上清转入新的EP管中。EP管需作好标识，并注意防止字迹被有机溶剂侵蚀；
（3）加入氯仿进行抽提，以去除蔗糖、蛋白等杂质，促进水相与有机相的分离。每1
ml Trizol至少加入0.2ml氯仿（1/5体积）。盖紧样品瓶盖，用手用力摇晃试管15s使其充分混匀，室温静置5min。
注意！
不能使用vortex，否则引起DNA污染。
（4）加入异丙醇沉淀水相RNA。加入氯仿静置完成后，12000rpm，4℃，离心15min，此时分相为三层。小心地将上层水相转入新的1.5ml无RNA酶离心管中（约400-500μl），再加入等体积的异丙醇（按照0.5ml异丙醇/ml
Trizol加入），混匀后，室温放置10min或者-20℃中1小时。
注意！加入氯仿离心后分相为三层。从上至下分别为：上层水相（含RNA）、中间层白色（含蛋白质和DNA）、下层红色（含蛋白质、DNA、苯酚及氯仿等）。吸取水相时不要吸取任何中间层物质！！！
若同时提取DNA和蛋白质，则可保留下层酚相存于4℃冰箱。若只提RNA，则弃下层酚相。
（5）12000rpm，4℃，离心10min，小心弃上清。（离心前RNA沉淀经常看不见，离心后在管侧或管壁形成胶状沉淀）。
（6）加入75%乙醇洗涤RNA沉淀，以使RNA沉淀中的盐离子被充分溶解。加入1
ml 75%乙醇，将RNA沉淀弹起漂洗。每使用1
ml Trizol则至少使用1
ml 75%乙醇对RNA沉淀进行洗涤。
注意！ RNA沉淀可保存在75%乙醇中，2-8℃一周以上，或者-20℃一年以上。
（7）RNA沉淀洗涤后，12000rpm，4℃，离心10min。弃上清，注意不要倒出沉淀，剩余少量液体短暂离心后用枪头吸出，注意不要吸弃沉淀！
注意！ 用75%乙醇洗涤RNA时，要洗两遍。
（8）将EP管打开置于超净台吹干（大概15min左右）。RNA沉淀不能吹太干燥，因其完全干燥后很难溶解，但又要充分避免乙醇影响后续试验。
（9）根据试验需要以及RNA沉淀多少，加入适量DEPC水（10-100μl），反复吹打混匀，充分溶解RNA。
（10）定量（Nanodrop）：用紫外分光光度仪检测所提RNA，通过OD260/280
来检测RNA纯度及浓度。
五、注意事项
1. 高反转录酶的活性
该酶在高达48
℃时仍具有活性，而且特异性和cDNA产量更高。较高温度下进行反转录，能够减少RNA的二级结构，增加反转录的效率
2. 在实验中必须采取以下措施：戴一次性干净手套；使用 RNA 操作专用实验台；在操作过程中避免讲话等。通过以上办法可以防止实验者的汗液、唾液中的RNA分解酶的污染。
声明：该视频作品仅代表作者观点，用于共享科学技术。内容仅供大家参考，不代表本站立场。