水稻原生质体制备与转化

一、视频摘要

水稻是单子叶植物的模式植物，水稻功能基因组研究对于认识水稻基因调控机理以及复杂性状解析具有重要作用。水稻原生质体制备作为一项基础实验技术，对于利用细胞和生化等方法研究水稻基因功能具有重要影响。本视频主要介绍了水稻原生质体制备的关键步骤和简化操作方法，方便研究者更加快捷、方便地制备原生质体。

二、关键词

水稻、水稻原生质体、转化

三、实验样品信息，试剂、耗材或仪器

1. 样品信息
播种于生根培养基中的ZH11野生型水稻幼苗

2. 试剂和耗材

试剂见溶液配制，均为sigma品牌，cellulase R10（ONOZUKA-220323-01）,MACEROZYME R10（ONOZUKA-20317-01）

3. 仪器和软件

高速离心机：eppendorf-5810R

恒温培养箱

金属加热器

吉列刀片

一次性培养皿

四、实验操作

1.生长7-21天幼苗，取茎切成1 mm小块，放入9 cm圆皿的20 mL Manitol和MES溶液中，轻摇混匀（约5棵苗转一个质粒）

2.用100目筛子过滤，除去液体，用勺子将滤渣放进含有200 mL酶解液的250 mL三角瓶中，然后用锡箔纸包好，扎几个洞，28℃，50 rpm避光摇4h；

3.取10 μL显微镜下检测原生质体，枪头去尖（可省略）；

4.拿出瓶子，加入20 mL W5摇匀，然后用提前润湿的（W5）300目筛子过滤至9 cm圆皿中，再用蓝枪头引流至50 mL离心管中（可用W5洗几次至另一50 mL管中配平），150 rcf，7 min，升降速调为1，离心；

5.吸去上清，用约1.8 mL的W5轻轻悬起（先加一点悬起再加至1.8 mL，少量多次加），转至2 mL离心管，150 rcf，3 min，吸弃上清；

6.加入100× NμL的MMG液（N=转化质粒个数），轻轻重悬（双转按150 μL，三转按250 μL）；

7.在2 mL离心管中加入10 μL（10 μg，1 μg/μL）质粒，然后用去尖枪头吸取100 μL，轻弹混匀，用去尖枪头加（65℃预热后冷却至室温的）40% PEG 4000 110 μL（加一弹一，否则部分PEG接触少量细胞反应不均匀）；

8.将样品用锡箔纸包好，28℃平放15 min，然后加1.8 mL W5充分轻弹混匀后，150 rcf，离心3min；

9.小心吸弃上清，再加入1.8 mL W5洗一次（先加一点弹匀再加满），150 g，离心3 min，弃上清（蓝枪头套白枪头）；

10.加入1.8 mL W5，轻弹混匀后，28℃遮光平放，培养10-12 h；

11.轻弹混匀，150 g，离心3 min，吸弃上清，剩100 μL，轻弹，在共聚焦显微镜下观察。

五、注意事项

1.一般从下午2-3点开始切材料，合理安排时间，现在一般直接配40 mL酶解液。

2.原生质体重悬时需小心，不要太过剧烈，以免细胞破碎

溶液配制：

1.酶解液：

55℃孵育10 min，冷却至室温，再加入（以下为20 mL的量）：

0.1% BSA 200 μL（1g BSA固体溶于10 mL水中，100×，4℃保存）；

3.4 mM CaCl₂ 20 μL（3.774g固体溶于10 mL水中，100×，4℃保存）；

50 μg/mL Amp 20 μL （1:1000）；

β-巯基乙醇 7 μL（4℃，RNA区）。

2. W5（1L）：

混匀后用HCl调pH至5.7。

3. 40% PEG（300 mL）

先加10 mL ddH₂O溶解混匀，再加入：

混匀，55℃助溶，分装至2 mL离心管中，-20℃保存。

4.MMG（50mL）

5. 400 mM MES (50 mL)

3.905 g MES溶于50 mL ddH₂O中，用NaOH调至pH=5.7，0.22 μM抽滤，4℃保存。