一、视频摘要
丙型肝炎是一种严重的传染性疾病,属于全球公共卫生问题,丙型肝炎病毒(HCV)感染是造成该疾病的主要原因。[1]抗-HCV检测窗口期较长(8~12周的窗口期,部分患者甚至可长达5~8个月[2])、无法区分既往感染与现症感染,且易出现假阳性、假阴性结果,而HCV
RNA检测因其灵敏度高、特异性强、线性范围宽、携带污染低、检测反应时间短、自动化程度高等优点,可实现对HCV感染的精准诊治[3]。因此,本人对于HCV-RNA的检测原理、步骤及结果解读进行了详细的视频介绍。
二、关键词
HCV-RNA
HCV 丙型肝炎病毒 RNA
三、实验样品信息,试剂、耗材或仪器
1. 样品信息
潍坊市人民医院患者血清
2. 试剂和耗材
试剂:
a.质控品
b.阴阳性对照品
c.HCV内标
d.RNA提取液1、2、3、4
e.PCR反应液
耗材:
a.薄壁0.2ml9联PCR高管+光学平盖
b.带滤芯200微升枪头、1ml枪头、10微升枪头
3. 仪器和软件
a.Quantitative
Real-time RCR仪
b.超速离心机
c.磁珠分离器
d.Thermo移液器
四、实验操作
1、试剂准备
a.各组分室温放置,混匀备用。
b.RNA提取液1=mix制备
RNA提取试剂1
600微升+HCV内标0.4微升
c.PCR=mix的制备
PCR反应液49微升+RT增强剂1微升
2、样本处理
-
1.5ml离心管依次加入600μLRNA提取液1-mix、200μL样本/质控品/阴阳性、100μLRNA提取液2。
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震荡混匀,静置10min。瞬时离心后吸弃废液
-
加入600μLRNA提取液3和200μLRNA提取液4
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瞬时离心后吸弃废液,再离心,磁珠分离器上静置5min,弃残液
-
加入50μLRCR-mix,用吸头吹打,洗下磁珠颗粒
-
将全部磁珠液转移至PCR反应管,上机检测
3、PCR扩增
a.FAM通道——检测HCV-RNA
HEX或VIC通道——检测HCV内标
多比荧光——选择ROC,设置Sample
Volume为50
b.循环参数设定
五、注意事项
1.注意样本之间、质控品、阴阳对照品之内不要交叉污染,导致PCR结果假阴或者假阳。
2.在移液器操作过程中,注意不要多加或者少加,会造成结果与原结果相比偏高或偏低。
3.在去除上清液过程中,注意不要碰到或者吸到下面沉淀,会造成结果偏低。
4.在盖PCR平盖时,注意盖子的盖严,否则会造成RT-PCR仪的污染
5.加PCR反应液前,注意反应液的混匀,否则会造成IC曲线与阈值线无交点,导致结果无意义。
六、结果分析(可选)
阈值线调整为0.025,IC为内标线,内标线与阈值线相交则结果有意义。
阈值线与反应曲线相交点的值为CT值,CT值约大,HCV-RNA浓度越低;CT值越低,HCV-RNA浓度越高。
七、参考文献(可选)
[1] Blach
S, Zeuzem S, Manns M, et al. Global prevalence and genotype
distribution of hepatitis c virus infection in 2015: a modelling
study[J]. The Lancet Gastroenterology & Hepatology, 2017, 2(3):
161–176. DOI:10.1016/S2468-1253(16)30181-9.
[2] Swellam
M, Mahmoud M S, Ali A A-F. Diagnosis of hepatitis c virus infection
by enzyme-linked immunosorbent assay and reverse transcriptase-nested
polymerase chain reaction: a comparative evaluation[J]. IUBMB Life,
2011, 63(6): 430–434. DOI:10.1002/iub.469.
[3] Razavi
H, Robbins S, Zeuzem S, et al. Hepatitis c virus prevalence and level
of intervention required to achieve the who targets for elimination
in the european union by 2030: a modelling study[J]. The Lancet
Gastroenterology & Hepatology, 2017, 2(5): 325–336.
DOI:10.1016/S2468-1253(17)30045-6.
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