HCV-RNA的定量检测

一、视频摘要

丙型肝炎是一种严重的传染性疾病,属于全球公共卫生问题,丙型肝炎病毒（HCV）感染是造成该疾病的主要原因。^[1]抗-HCV检测窗口期较长（8～12周的窗口期，部分患者甚至可长达5～8个月^[2]）、无法区分既往感染与现症感染，且易出现假阳性、假阴性结果，而HCV RNA检测因其灵敏度高、特异性强、线性范围宽、携带污染低、检测反应时间短、自动化程度高等优点，可实现对HCV感染的精准诊治^[3]。因此，本人对于HCV-RNA的检测原理、步骤及结果解读进行了详细的视频介绍。

二、关键词

HCV-RNA HCV 丙型肝炎病毒 RNA

三、实验样品信息，试剂、耗材或仪器

1. 样品信息

潍坊市人民医院患者血清

2. 试剂和耗材

试剂：

a.质控品

b.阴阳性对照品

c.HCV内标

d.RNA提取液1、2、3、4

e.PCR反应液

耗材：

a.薄壁0.2ml9联PCR高管+光学平盖

b.带滤芯200微升枪头、1ml枪头、10微升枪头

3. 仪器和软件

a.Quantitative Real-time RCR仪

b.超速离心机

c.磁珠分离器

d.Thermo移液器

四、实验操作

1、试剂准备

a.各组分室温放置，混匀备用。

b.RNA提取液1=mix制备

RNA提取试剂1 600微升+HCV内标0.4微升

c.PCR=mix的制备

PCR反应液49微升+RT增强剂1微升

2、样本处理

• 1.5ml离心管依次加入600μLRNA提取液1-mix、200μL样本/质控品/阴阳性、100μLRNA提取液2。

• 震荡混匀，静置10min。瞬时离心后吸弃废液

• 加入600μLRNA提取液3和200μLRNA提取液4

• 瞬时离心后吸弃废液，再离心，磁珠分离器上静置5min，弃残液

• 加入50μLRCR-mix，用吸头吹打，洗下磁珠颗粒

• 将全部磁珠液转移至PCR反应管，上机检测

3、PCR扩增

a.FAM通道——检测HCV-RNA

HEX或VIC通道——检测HCV内标

多比荧光——选择ROC，设置Sample Volume为50

b.循环参数设定

五、注意事项

1.注意样本之间、质控品、阴阳对照品之内不要交叉污染，导致PCR结果假阴或者假阳。

2.在移液器操作过程中，注意不要多加或者少加，会造成结果与原结果相比偏高或偏低。

3.在去除上清液过程中，注意不要碰到或者吸到下面沉淀，会造成结果偏低。

4.在盖PCR平盖时，注意盖子的盖严，否则会造成RT-PCR仪的污染

5.加PCR反应液前，注意反应液的混匀，否则会造成IC曲线与阈值线无交点，导致结果无意义。

六、结果分析（可选）

阈值线调整为0.025，IC为内标线，内标线与阈值线相交则结果有意义。

阈值线与反应曲线相交点的值为CT值，CT值约大，HCV-RNA浓度越低；CT值越低，HCV-RNA浓度越高。

七、参考文献（可选）

[1] Blach S, Zeuzem S, Manns M, et al. Global prevalence and genotype distribution of hepatitis c virus infection in 2015: a modelling study[J]. The Lancet Gastroenterology & Hepatology, 2017, 2(3): 161–176. DOI:10.1016/S2468-1253(16)30181-9.

[2] Swellam M, Mahmoud M S, Ali A A-F. Diagnosis of hepatitis c virus infection by enzyme-linked immunosorbent assay and reverse transcriptase-nested polymerase chain reaction: a comparative evaluation[J]. IUBMB Life, 2011, 63(6): 430–434. DOI:10.1002/iub.469.

[3] Razavi H, Robbins S, Zeuzem S, et al. Hepatitis c virus prevalence and level of intervention required to achieve the who targets for elimination in the european union by 2030: a modelling study[J]. The Lancet Gastroenterology & Hepatology, 2017, 2(5): 325–336. DOI:10.1016/S2468-1253(17)30045-6.