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第三代纳米孔测序上样及磁珠纯化DNA过程

吴子麒 |  2022-11-23  | DOI: 10.21769/BioProtoc.v1068
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视频简介第三代纳米孔测序上样过程,前期的DNA样品制备建库的操作里,让DNA的浓度和质量损失最严重的就是磁珠纯化DNA的步骤,为了让大家能减少DNA的损失,特别制作了磁珠纯化DNA的操作步骤。后期的第三代纳米孔测序上样,有很多实验员因为初次使用纳米孔测序芯片上样,不熟悉操作步骤而导致错误加入试剂导致芯片无法正常使用。特此做了这一个视频,为大家详细讲解第三代纳米孔测序最后上样的操作步骤。
  • 视频介绍

一、视频摘要

在第三代纳米孔测序上样的过程中,DNA样品纯化和建库上样的过程是最关键的步骤,本实验意在帮助实验者减少DNA纯化的损失和避免建库上样的错误操作。


二、关键词

第三代纳米孔测序,建库上样,DNA纯化

三、实验样品信息,试剂、耗材或仪器

1. 样品信息:

2. 试剂和耗材:

  • 第三代纳米孔测序芯片

  • 1ml200µl10µl 移液枪

  • 2 ml 离心管

  • 80% 乙醇

  • 磁珠吸附磁力架

  • 水平均质涡旋仪


3. 仪器和软件

四、实验操作

DNA纯化过程

  1. 先将磁珠溶液和DNA样品按一定体积比例加入到1.5ml试管中,然后将磁珠溶液与DNA样品均匀混合

  2. 用左手捏紧试管盖,右手食指轻微拨动试管底部;请不要使用移液枪吹打混匀,将装有混匀溶液的试管放置在涡旋混匀仪上,涡旋混匀5分钟

  3. 涡旋混匀结束后,取下试管,将试管放在低速离心仪上稍做离心。

  4. 将离心后的试管放置在磁力架上,配置所需使用80%体积的乙醇溶液

  5. 轻微打开试管盖后,用食指拨开试管盖,拇指抵住试管,切勿触碰到试管盖的内圈,用200ul的移液枪从远离磁力架的一侧伸入试管底部,缓慢吸取所有残留的溶液,切勿吸取到黑色磁珠

  6. 吸取200ul体积80%乙醇溶液,沿着远离磁力架的一侧,伸入试管中部,缓慢加入乙醇溶液,合上试管盖,静置30

  7. 30秒后,按200ul的移液枪量程到底部,从远离磁力架一侧伸入试管底部吸出所有溶液

  8. 重复加入和吸出洗脱乙醇溶液的过程两次

  9. 将移液枪调整到适合量程,吸取无核酸水,沿着试管壁悬挂磁珠的一侧缓慢滴加无核酸水,然后将试管放置到磁力架上,磁珠溶液会缓慢的吸附到试管靠近磁力架的一侧,静置5分钟

  10. 缓慢打开试管盖,用20ul的移液枪沿着远离磁力架一侧伸入试管底部,缓慢吸取液体,将吸取完全的液体转移到新的1.5ml 离心管中待后续上样使用。

第三代纳米孔上样过程

  1. 1ml的移液枪调整至800ul,打开priming port,将枪头尖对准孔位,左手扶持移液枪,右手缓慢地沿逆时针方向旋转量程,待枪头尖有保护液吸出时即可停止旋扭

  2. 紧接着我们第一次用loading buffer去冲洗芯片上的保护液

  3. 将移液枪调整至820ul,吸取loading buffer,注意吸取液体中没有气泡,打开priming port,枪头尖对准孔位,缓慢打入loading buffer,最后在枪尖保留一点液体从而避免有气泡进入通道,静置5分钟

  4. 首先旋开priming port,接着掀开spot on,准备第二次从priming port加入Loading Buffer

  5. 取出剩余的loading buffer,调整移液枪至220ul,吸取loading buffer,将枪头尖对准孔位,缓慢打入loading buffer,注意不能让spot on的液体溢出

  6. 紧接着迅速滴加DNA样品,调整移液枪至75ul,吸取建制完成的DNA样品,注意枪头中不能有气泡,然后将枪尖悬置在spot on 孔上方,缓慢滴加液体,待所有的液体完全吸入孔内,

  7. 合上spot on,旋回priming port,合上测序仪,进行测序。

五、注意事项

  1. 当我们拿到纳米孔测序芯片的时候,要注意先去除上样通道中的存在气泡

  2. 两个过程中,需要实验者温柔地进行操作,切勿用力过猛。

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