第三代纳米孔测序上样及磁珠纯化DNA过程

一、视频摘要

在第三代纳米孔测序上样的过程中，DNA样品纯化和建库上样的过程是最关键的步骤，本实验意在帮助实验者减少DNA纯化的损失和避免建库上样的错误操作。

二、关键词

第三代纳米孔测序，建库上样，DNA纯化

三、实验样品信息，试剂、耗材或仪器

1. 样品信息：

2. 试剂和耗材：

• 第三代纳米孔测序芯片

• 1ml，200µl，10µl 移液枪

• 2 ml 离心管

• 80% 乙醇

• 磁珠吸附磁力架

• 水平均质涡旋仪

3. 仪器和软件

四、实验操作

DNA纯化过程

1. 先将磁珠溶液和DNA样品按一定体积比例加入到1.5ml试管中，然后将磁珠溶液与DNA样品均匀混合

2. 用左手捏紧试管盖，右手食指轻微拨动试管底部；请不要使用移液枪吹打混匀，将装有混匀溶液的试管放置在涡旋混匀仪上，涡旋混匀5分钟

3. 涡旋混匀结束后，取下试管，将试管放在低速离心仪上稍做离心。

4. 将离心后的试管放置在磁力架上，配置所需使用80%体积的乙醇溶液

5. 轻微打开试管盖后，用食指拨开试管盖，拇指抵住试管，切勿触碰到试管盖的内圈，用200ul的移液枪从远离磁力架的一侧伸入试管底部，缓慢吸取所有残留的溶液，切勿吸取到黑色磁珠

6. 吸取200ul体积80%乙醇溶液，沿着远离磁力架的一侧，伸入试管中部，缓慢加入乙醇溶液，合上试管盖，静置30秒

7. 待30秒后，按200ul的移液枪量程到底部，从远离磁力架一侧伸入试管底部吸出所有溶液

8. 重复加入和吸出洗脱乙醇溶液的过程两次

9. 将移液枪调整到适合量程，吸取无核酸水，沿着试管壁悬挂磁珠的一侧缓慢滴加无核酸水，然后将试管放置到磁力架上，磁珠溶液会缓慢的吸附到试管靠近磁力架的一侧，静置5分钟

10. 缓慢打开试管盖，用20ul的移液枪沿着远离磁力架一侧伸入试管底部，缓慢吸取液体，将吸取完全的液体转移到新的1.5ml 离心管中待后续上样使用。

第三代纳米孔上样过程

1. 将1ml的移液枪调整至800ul，打开priming port，将枪头尖对准孔位，左手扶持移液枪，右手缓慢地沿逆时针方向旋转量程，待枪头尖有保护液吸出时即可停止旋扭

2. 紧接着我们第一次用loading buffer去冲洗芯片上的保护液

3. 将移液枪调整至820ul，吸取loading buffer，注意吸取液体中没有气泡，打开priming port，枪头尖对准孔位，缓慢打入loading buffer，最后在枪尖保留一点液体从而避免有气泡进入通道，静置5分钟

4. 首先旋开priming port，接着掀开spot on，准备第二次从priming port加入Loading Buffer

5. 取出剩余的loading buffer，调整移液枪至220ul，吸取loading buffer，将枪头尖对准孔位，缓慢打入loading buffer，注意不能让spot on的液体溢出

6. 紧接着迅速滴加DNA样品，调整移液枪至75ul，吸取建制完成的DNA样品，注意枪头中不能有气泡，然后将枪尖悬置在spot on 孔上方，缓慢滴加液体，待所有的液体完全吸入孔内，

7. 合上spot on，旋回priming port，合上测序仪，进行测序。
   

五、注意事项

1. 当我们拿到纳米孔测序芯片的时候，要注意先去除上样通道中的存在气泡

2. 两个过程中，需要实验者温柔地进行操作，切勿用力过猛。