通过FunGI的小鼠结肠组织透明化

一、视频摘要

通过FunGI的组织透明化技术路线是利用FunGI试剂对组织的脂质、蛋白质等成分进行透明化，再利用免疫荧光技术进行显影，以验证透明化成果，该技术发展时间虽较短，但能使组织达到光学透明成都，进而增加成像深度和图像对比度的技术，再利用抗原抗体相结合的方法，即可在荧光显微镜下验证透明化效果，若结合疾病模型动物，或可以对病灶进行相关的靶点检测，能直观观测到相应指标，在组织水平的蛋白表达检测中具有较为广阔的前景。

二、关键词

组织透明化、FunGI，免疫荧光

三、实验样品信息，试剂、耗材或仪器

1. 样品信息

C57BL/6 mice

2. 试剂和耗材

1. 4% PFA

           44g PFA, 1100ml dd H₂O

2. 50ug/ml Ascorbic Acid

           3.5mg Ascorbic Acid(s), 70ml dd H₂O

3. WB 1

           20ml PBS, 0.04ml Tween-20, 0.04ml Triton, 0.004ml SDS, 0.04ml BSA、20ml 50ug/ml Ascorbic Acid、20ml Glutathione

4. WB 2

           15ml PBS, 0.015ml Triton, 0.003ml SDS, 0.03ml BSA, 15ml 50ug/ml Ascorbic Acid, 15ml Glutathione

5. 0.05ug/ml Glutathione

           5ng Glutathione (s), 100ml dd H₂O

6. Wash Buffer

           20ml PBS、0.02ml Tween-20、20ml 50mg/ml Ascorbic Acid

7. PBS+0.1% Tween-20

           10ml PBS、0.01ml Tween-20

8. FunGl

           20g Fructose (s), 4.66ml Tris-EDTA 9pH=8) ,22ml Glycerine、6.62g Urea (s)

9. Tris-EDTA

           0.05ml 1M Tris-HCI、0.01ml 0.5M EDTA、4ml dd H₂O（混匀后定容到5ml）

3. 仪器和软件

Cytation 5 by biotek.

Gen5 software to control C5 and to process image and statistics.

四、实验操作

1.灌注

配制1100ml 4%PFA[pH=7.4]溶液，腹腔注射4% CCl₃麻醉后打开小鼠胸腹盆腔，剥离胸廓表面皮肤、肌肉后暴露出胸肋关节，沿小鼠胸骨锁切迹剪开胸廓，暴露心包后将其剪开，暴露心脏后剪开右心房，将静脉采血针以15度夹角穿刺于左心室，灌注PBS溶液20ml 2-3次至液体澄清后，改用4%PFA溶液进行灌注，约2次后可观察到小鼠尾部翘起，说明灌注成功，可进行下一步操作。

2.取材固定

先使用4℃ 4%PFA溶液 5ml*2 (pH=7.4浸泡90min，再用PBS+0.1% Tween-20 5ml*2摇床洗 10min，然后用 30ml*2 Wash Buffer 4℃摇床摇 30min即可。

3.免疫荧光标记

先用25ml*2 WB 1 封闭 150min后，预冷WB2 稀释一抗（F480）至总体积为500-1000u1 4℃于垂直放至于试管内过夜孵育后，在4℃摇床用WB2洗3次，每次1h；再预冷 WB2 稀释二抗（1/500，兔抗）至500-1000ul 4℃垂直孵化至少7h后用WB2 摇床洗3次，每次1h后进行下一步。

4.透明化

10ml FunGl 室温下避光放置2h孵育或4℃过夜避光孵育。
5.成像

荧光显微镜下成像即可。

五、注意事项

1.PFA需要在通风橱配置；

2.Reagents的配置需要注意溶液的吸取，因甘油，吐温-20等试剂较为粘稠，故若吸取液体过快会导致移液量不准确，造成误差，从而影响实验效果；

3.孵育过程中注意避光，避免荧光淬灭导致成像时不能显影。