一、视频摘要
通过FunGI的组织透明化技术路线是利用FunGI试剂对组织的脂质、蛋白质等成分进行透明化,再利用免疫荧光技术进行显影,以验证透明化成果,该技术发展时间虽较短,但能使组织达到光学透明成都,进而增加成像深度和图像对比度的技术,再利用抗原抗体相结合的方法,即可在荧光显微镜下验证透明化效果,若结合疾病模型动物,或可以对病灶进行相关的靶点检测,能直观观测到相应指标,在组织水平的蛋白表达检测中具有较为广阔的前景。
二、关键词
组织透明化、FunGI,免疫荧光
三、实验样品信息,试剂、耗材或仪器
1. 样品信息
C57BL/6
mice
2. 试剂和耗材
-
4%
PFA
44g
PFA, 1100ml dd H2O
-
50ug/ml
Ascorbic Acid
3.5mg
Ascorbic Acid(s), 70ml dd H2O
-
WB
1
20ml
PBS, 0.04ml Tween-20, 0.04ml Triton, 0.004ml SDS, 0.04ml BSA、20ml
50ug/ml Ascorbic Acid、20ml
Glutathione
-
WB
2
15ml
PBS, 0.015ml Triton, 0.003ml SDS, 0.03ml BSA, 15ml 50ug/ml Ascorbic
Acid, 15ml Glutathione
-
0.05ug/ml
Glutathione
5ng
Glutathione (s), 100ml dd H2O
-
Wash
Buffer
20ml
PBS、0.02ml
Tween-20、20ml
50mg/ml Ascorbic Acid
-
PBS+0.1%
Tween-20
10ml
PBS、0.01ml
Tween-20
-
FunGl
20g
Fructose (s), 4.66ml Tris-EDTA 9pH=8) ,22ml Glycerine、6.62g
Urea (s)
-
Tris-EDTA
0.05ml
1M Tris-HCI、0.01ml
0.5M EDTA、4ml
dd H2O(混匀后定容到5ml)
3. 仪器和软件
Cytation
5 by biotek.
Gen5
software to control C5 and to process image and statistics.
四、实验操作
1.灌注
配制1100ml
4%PFA[pH=7.4]溶液,腹腔注射4%
CCl3麻醉后打开小鼠胸腹盆腔,剥离胸廓表面皮肤、肌肉后暴露出胸肋关节,沿小鼠胸骨锁切迹剪开胸廓,暴露心包后将其剪开,暴露心脏后剪开右心房,将静脉采血针以15度夹角穿刺于左心室,灌注PBS溶液20ml
2-3次至液体澄清后,改用4%PFA溶液进行灌注,约2次后可观察到小鼠尾部翘起,说明灌注成功,可进行下一步操作。
2.取材固定
先使用4℃
4%PFA溶液 5ml*2
(pH=7.4浸泡90min,再用PBS+0.1%
Tween-20 5ml*2摇床洗 10min,然后用 30ml*2
Wash Buffer 4℃摇床摇 30min即可。
3.免疫荧光标记
先用25ml*2
WB 1 封闭 150min后,预冷WB2 稀释一抗(F480)至总体积为500-1000u1
4℃于垂直放至于试管内过夜孵育后,在4℃摇床用WB2洗3次,每次1h;再预冷 WB2 稀释二抗(1/500,兔抗)至500-1000ul
4℃垂直孵化至少7h后用WB2 摇床洗3次,每次1h后进行下一步。
4.透明化
10ml
FunGl 室温下避光放置2h孵育或4℃过夜避光孵育。
5.成像
荧光显微镜下成像即可。
五、注意事项
1.PFA需要在通风橱配置;
2.Reagents的配置需要注意溶液的吸取,因甘油,吐温-20等试剂较为粘稠,故若吸取液体过快会导致移液量不准确,造成误差,从而影响实验效果;
3.孵育过程中注意避光,避免荧光淬灭导致成像时不能显影。
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