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通过FunGI的小鼠结肠组织透明化

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视频简介本小组通过组织透明化的技术路线对小鼠结肠组织进行透明化处理,并通过免疫荧光手段进行透明化的确认。 本次指导老师:罗连响 技术指导:邓丽燕 林敏萍 郭诺情 刘雪琴 实验准备:郑梓颖 刘颖琦 实验操作:杨昌年(负责人) 李锦阳 拍摄剪辑:陈灏轩
  • 视频介绍

一、视频摘要

通过FunGI的组织透明化技术路线是利用FunGI试剂对组织的脂质、蛋白质等成分进行透明化,再利用免疫荧光技术进行显影,以验证透明化成果,该技术发展时间虽较短,但能使组织达到光学透明成都,进而增加成像深度和图像对比度的技术,再利用抗原抗体相结合的方法,即可在荧光显微镜下验证透明化效果,若结合疾病模型动物,或可以对病灶进行相关的靶点检测,能直观观测到相应指标,在组织水平的蛋白表达检测中具有较为广阔的前景。

二、
关键词

组织透明化、FunGI,免疫荧光


三、实验样品信息,试剂、耗材或仪器

1. 样品信息

C57BL/6 mice

2. 试剂和耗材

  1. 4% PFA

           44g PFA, 1100ml dd H2O

  1. 50ug/ml Ascorbic Acid

           3.5mg Ascorbic Acid(s), 70ml dd H2O

  1. WB 1

           20ml PBS, 0.04ml Tween-20, 0.04ml Triton, 0.004ml SDS, 0.04ml BSA20ml 50ug/ml Ascorbic Acid20ml Glutathione

  1. WB 2

           15ml PBS, 0.015ml Triton, 0.003ml SDS, 0.03ml BSA, 15ml 50ug/ml Ascorbic Acid, 15ml Glutathione

  1. 0.05ug/ml Glutathione

           5ng Glutathione (s), 100ml dd H2O

  1. Wash Buffer

           20ml PBS0.02ml Tween-2020ml 50mg/ml Ascorbic Acid

  1. PBS+0.1% Tween-20

           10ml PBS0.01ml Tween-20

  1. FunGl

           20g Fructose (s), 4.66ml Tris-EDTA 9pH=8) ,22ml Glycerine6.62g Urea (s)

  1. Tris-EDTA

           0.05ml 1M Tris-HCI0.01ml 0.5M EDTA4ml dd H2O(混匀后定容到5ml


3. 仪器和软件

Cytation 5 by biotek.

Gen5 software to control C5 and to process image and statistics.


四、实验操作

1.灌注

配制1100ml 4%PFA[pH=7.4]溶液,腹腔注射4% CCl3麻醉后打开小鼠胸腹盆腔,剥离胸廓表面皮肤、肌肉后暴露出胸肋关节,沿小鼠胸骨锁切迹剪开胸廓,暴露心包后将其剪开,暴露心脏后剪开右心房,将静脉采血针以15度夹角穿刺于左心室,灌注PBS溶液20ml 2-3次至液体澄清后,改用4%PFA溶液进行灌注,约2次后可观察到小鼠尾部翘起,说明灌注成功,可进行下一步操作。

2.取材固定

先使用4℃ 4%PFA溶液 5ml*2 (pH=7.4浸泡90min,再用PBS+0.1% Tween-20 5ml*2摇床洗 10min,然后用 30ml*2 Wash Buffer 4℃摇床摇 30min即可。

3.免疫荧光标记

先用25ml*2 WB 1 封闭 150min后,预冷WB2 稀释一抗(F480)至总体积为500-1000u1 4℃于垂直放至于试管内过夜孵育后,在4℃摇床用WB23次,每次1h;再预冷 WB2 稀释二抗(1/500,兔抗)至500-1000ul 4℃垂直孵化至少7h后用WB2 摇床洗3次,每次1h后进行下一步。

4.透明化

10ml FunGl 室温下避光放置2h孵育或4℃过夜避光孵育。
5.
成像

荧光显微镜下成像即可。


五、注意事项

1.PFA需要在通风橱配置;

2.Reagents的配置需要注意溶液的吸取,因甘油,吐温-20等试剂较为粘稠,故若吸取液体过快会导致移液量不准确,造成误差,从而影响实验效果;

3.孵育过程中注意避光,避免荧光淬灭导致成像时不能显影。


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