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质粒提取

葛萧 |  2022-11-23  | DOI: 10.21769/BioProtoc.v1074
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视频简介利用试剂盒根据碱裂解法的原理,结合方便快捷的硅膜离心技术,提取大肠杆菌中的质粒。具有高效,快捷的特点,得到相对较纯的质粒,以供后续的酶切转化等步骤。
  • 视频介绍

一、视频摘要

质粒提取即去除 RNA,将质粒与细菌基因组 DNA分开,去除蛋白质及其它杂质,以得到相对纯净的质粒。


二、关键词

质粒提取,试剂盒提取,操作方法


三、实验样品信息,试剂、耗材或仪器

1. 样品信息

带有需提质粒的LB培养基过夜培养后的大肠杆菌

2. 试剂和耗材

全式金质粒提取试剂盒

1ml加样枪,枪头

100ul加样枪,枪头

2 ml EP

试管架

3. 仪器和软件

小型高速离心机

金属浴


四、实验操作

1. 取过夜培养的菌液1 ml12000rpm1min,弃上清。

2. 加入250ul RB,震荡悬浮细菌沉淀,不留小块。

3. 加入250ul LB(蓝色),温和地上下翻转,混合4-6次,充分裂解菌体,形成蓝色透亮的溶液,颜色由半透亮变为透亮蓝色,指示完全裂解。(不宜超过5min

4. 加入350ul NB(黄色),轻轻混合5-6次,颜色由蓝色完全变成黄色,指示混合均匀,中和完全,直至形成紧实的黄色凝集块,室温静置2min

5. 12000rpm离心10min,吸取上清加入离心柱中。静置5min12000rpm1min,弃去流出液。

6. 加入650ul WB12000rpm1min,弃去流出液。

7. 12000rpm离心2min,彻底去除残留的WB

8. 将离心柱置于一干净的离心管中,晾干酒精10min,在柱中央加入50ulEB65℃预热),室温静置5min

9. 12000rpm1min,洗脱。

10. 流出液即为目的质粒。标记质粒名称,日期等留待后续实验。


五、注意事项

1.加入LB后,时间不超过5min

2.吸附柱应当晾干酒精,且注意不要戳破滤膜

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