小鼠脑室管膜上皮的纤毛运动与液体流的实时成像

一、视频摘要

排列在脑室管膜的上皮细胞，也称为E1细胞¹，通过多纤毛运动产生定向脑脊液流^2,3，进而维持大脑内稳态³。纤毛运动缺陷会引起脑脊液流的异常，从而导致脑积水^1-4。为了能产生定向脑脊液流，E1细胞必须协调每个细胞和邻近细胞间的纤毛摆动³。以往研究文献对纤毛运动的成像多集中在小视野范围，即只含少量细胞，并且难以同时进行液体流的追踪与对应纤毛运动的成像^2,3,5。基于以前的方法^2,3,5，这里，我们描述了一种改良的实验技术，即对新鲜的脑室管膜上皮组织进行250 μm厚度的振动切片，随后对切片上的多纤毛进行活体标记，并加入荧光微球标记液体流，最后利用快速转盘共聚焦显微镜观察大视野里E1细胞的纤毛运动以及追踪相应的液体流。

摘要模式图:

二、关键词

小鼠脑室管膜上皮、纤毛运动、脑脊液流、实时成像、振动切片

三、实验样品信息，试剂、耗材或仪器

1. 样品信息

4周龄野生型小鼠，小鼠遗传背景为C57/BL6。

2. 试剂和耗材

1. 0.22 μm过滤器 (Millipore, SLGPR33RB)

2. 50 mL离心管 (Falcon, 352070)

3. 35 mm玻璃底活体皿 (Cellvis, D35-20-1.5-N)

4. 10 cm活体皿 (Ctrueblue, CT221030)

5. 超纯水

6. 培养液 (ThermoFisher Scientific, Gibco^TM, 12430054)，4°C储存

7. 显微镜镜油 (Lecia microsystem, 12847995)

8. 解剖缓冲液 (详见试剂配方补充)，4°C储存

9. 组织切片培养液 (详见试剂配方补充)，储存

10. SiR-tubulin (Spirochrome, SC002)

11. 荧光微球 (250 nm直径) (Invitrogen, F8809)

12. 双面刀面 (Flying Eagle, 74-C)

13. 纯狼毫勾线笔 (Marie, G1225A)

14. 试剂配方补充

解剖液，pH 7.4：

用0.22 μm过滤器过滤后, 4°C储存。

组织切片培养液：

4°C储存。

3. 仪器和软件

1. 超纯水制备系统 (Millipore, model: Advantage A10)

2. 锋利镊子(Dumont, 0208-5/45-PO)

3. 镊子 (Dumont, 0203-5/15-PO)

4. 配备DP72 相机的宽场体视镜 (Olympus, SZX16)

5. 振动切片机 (Leica, Leica VT1000S)

6. 配备63×/1.4油浸物镜共聚焦显微镜(Leica, TCS SP8 WLL system)

7. 配备Hamamatsu ORCA-Fusion相机的转盘共聚焦超分辨率显微镜 (Olympus, IX83 P2ZF)

8. 显微镜自带操作系统以及Fiji软件。

四、实验操作

1. 分离出小鼠脑室管膜组织

1. 用二氧化碳处死小鼠。

2. 用酒精棉球擦拭小鼠头部毛发，依次用手术剪刀剪开小鼠头皮和头盖骨。

3. 用镊子将完整的小鼠大脑取出，在装有预热 (37°C) 解剖液的解剖皿中涮掉血液，转移到新的解剖皿中。

4. 在宽场体视镜下解剖：用镊子将左右半脑分开，然后去除多余的区域，例如海马体，小脑等，暴露出室管膜（图1）。

5. 轻轻将剥离的室管膜组织转移到新的35mm玻璃底活体皿中。注意:含纤毛面朝上。

图1. 解剖小鼠脑室管膜组织

2. 用振动切片机切出250 μm厚度的室管膜组织切片

1. 用镊子托起新鲜室管膜组织，组织背面轻触纸巾以吸掉表面水分（以便步骤c使用强力胶水，详见视频操作）。

2. 进行横切，需要将室管膜组织的多纤毛表面的前-后轴平行于刀片，放置在缓冲盘上。

3. 用强力胶把组织粘在缓冲盘上，等胶水干时，进行下一步。注：保持室管膜湿润。

4. 将缓冲盘小心地插入切片机活塞支架上，将预热好的解剖液倒入缓冲盘中。

5. 将新的刀片固定在刀架上（详见视频操作）。

6. 将大约500 l的预热解剖液加入35 mm玻璃底活体皿中，待用。

7. 参数的设置取决于具体的切片类型。250 μm厚的小鼠脑室管膜切片，频率设定为80-100 Hz，振幅0.75-1 mm，推进速度0.1-0.5 mm/s。

注意：这样的厚度可以保证切片漂浮，在后续观察时组织切片不会沉到活体皿底。

8. 根据制造商的说明书对组织样品进行切片。

9. 用纯狼毫勾线笔拖起组织切片背面，保证多纤毛面（正面）朝上，捞出组织切片到步骤f的活体皿中，标记样品信息。

3. 用染料SiR-tubulin标记纤毛

1. 准备一个新的35 mm玻璃底活体皿，在皿中加入含浓度为100 nM SiR-tubulin的培养液。

2. 用纯狼毫勾线笔转移组织切片到步骤a的活体皿中，保证多纤毛面（正面）朝上，在培养箱中培养30分钟至1小时，使得纤毛被充分标记上（图2）。

图2. SiR-tubulin标记纤毛示意图

注意:在整个培养过程中，纤毛面朝上。

4. 转盘共聚焦显微镜实时成像

1. 观察前先参数设置。荧光微球通道（561 nm）的激光功率设置为20%，以实现90 ms的曝光时间。曝光间隔设置为“无延迟”。SiR-tubulin通道（640 nm）的激光功率设置为80%，曝光时间为5 ms，曝光间隔设置为“无延迟”。为了能观察荧光微球流动以及对应的一大片E1细胞的纤毛摆动，选择在20倍物镜上进行实时成像。

2. 准备荧光微球：将荧光微球（beads）(直径为250 nm) 按1:500稀释在培养液中，待用。

1. 用纯狼毫勾线笔轻轻将切片翻转，使纤毛面朝下（图3）（因转盘共聚焦显微镜为倒置显微镜）。

2. 一旦观察到多纤毛摆动，小心地在切片表面加入步骤a的50 μl荧光微球。

图3.显微镜实时成像示意图

3. 首先成像荧光微球通道，聚焦在微球流（液体流）的清晰焦面，录制视频。然后快速录制纤毛通道的相同焦面。如果纤毛在同一焦面难以清晰观察，可以再调节焦面，聚焦到更深的焦面，直到能清晰录制到纤毛运动。

4. 图像用显微镜自带操作系统采集，后续用Fiji软件进行处理。

五、注意事项

详见（四、实验操作）。

六、结果分析

液体流与纤毛摆动实时成像详见视频。以下为处理后的代表性静态图像（图4）。

七、致谢

我们感谢中国科学院分子细胞科学卓越中心对该方法的仪器和技术支持。感谢Mirzadeh博士(加州大学旧金山分校- UCSF)的原始方法为我们的本文方法提供了参考。

八、利益冲突

无

九、动物伦理

小鼠实验方案均按照中国科学院分子细胞科学卓越中心的机构准则进行，并得到机构动物护理与使用委员会的批准。小鼠的喂养、管理和繁殖在中国科学院分子细胞科学卓越中心的动物核心设施进行。

十、参考文献

1 Ohata, S. et al. Loss of Dishevelleds disrupts planar polarity in ependymal motile cilia and results in hydrocephalus. Neuron 83, 558-571, doi:10.1016/j.neuron.2014.06.022 (2014).

2 Boutin, C. et al. A dual role for planar cell polarity genes in ciliated cells. Proc Natl Acad Sci U S A 111, E3129-3138, doi:10.1073/pnas.1404988111 (2014).

3 Mirzadeh, Z., Han, Y. G., Soriano-Navarro, M., Garcia-Verdugo, J. M. & Alvarez-Buylla, A. Cilia organize ependymal planar polarity. J Neurosci 30, 2600-2610, doi:10.1523/JNEUROSCI.3744-09.2010 (2010).

4 Mahuzier, A. et al. Ependymal cilia beating induces an actin network to protect centrioles against shear stress. Nat Commun 9, 2279, doi:10.1038/s41467-018-04676-w (2018).

5 Mirzadeh, Z., Doetsch, F., Sawamoto, K., Wichterle, H. & Alvarez-Buylla, A. The subventricular zone en-face: wholemount staining and ependymal flow. J Vis Exp, doi:10.3791/1938 (2010).