6色流式实验—细胞表面靶标染色

一、视频摘要

多色流式细胞技术是通过流式细胞仪对单个细胞或单个微粒进行多参数、快速分析的生物医学检测技术，本实验以小鼠脾脏组织M1、M2巨噬细胞比例的检测为例，重点展示了多色流式细胞实验样本制备、细胞计数和抗体染色的操作方法及注意事项。

二、关键词

流式细胞术，细胞表染，单细胞悬液。

三、实验样品信息，试剂、耗材或仪器

1.样品信息

小鼠脾脏组织细胞

2.试剂和耗材

试剂：预冷PBS、红细胞裂解液、封闭剂（CD16/CD32）、Brilliant Stain Buffer、各种抗体、Stain Buffer (FBS)

耗材：手术剪、镊子、50ml离心管、70um筛网、5ml注射器、流式管

3.仪器和软件

仪器：流式细胞仪、细胞计数仪、低温离心机

软件：BD FACSDiva™ Software

四、实验操作

（一）制备单细胞悬液

1.小鼠脱臼处死，酒精中浸泡消毒
2.解剖取出小鼠脾脏，使用预冷PBS清洗2遍
3.将脾脏转移至固定于离心管上的筛网中，使用5ml注射器内芯进行研磨，边研磨边用预冷的PBS进行冲洗
4.离心（4℃，300g, 5min）收集下层细胞悬液
5.加入2ml红细胞裂解液，混匀后室温裂解5min，加入2ml预冷PBS，混匀，离心，弃上清，使用2ml预冷PBS再次清洗，并重悬至1ml预冷PBS中。

（二）细胞计数

1.将混匀后的10ul单细胞悬液与10ul台盼兰混匀

2.转移至细胞计数板上，使用细胞计数仪进行计数

（三）抗体标记

1.按照106个细胞/管的数量将细胞分装在不同的流式管中，用PBS补足至1ml/管，离心洗一遍后，FSV510单阳管和Sample管重悬于1ml PBS，其他管重悬于100ul stain buffer FBS

2. FVS510染色（死活染料）：FVS510单阳和Sample管，每管加入1ul FVS510 stock，涡旋，室温避光反应15min，加入1ml stain buffer FBS终止反应，4℃，350×g，离心5min。倒掉上清，滤纸吸净残余液体，重悬于100ul stain buffer FBS.

3.封闭：除阴性管、FSV510单阳管外，所有管重悬于100 ul stain buffer FBS，每管加入2ul（1ug）Fc block，4℃反应5min。

4.抗体标记：Sample管加50 ul Brilliant stain buffer，涡旋，每管分别加入相应抗体，4℃孵育30 min。

5.加入1ml PBS,4℃，350×g，离心5min。
6.重悬于500ul stain buffer FBS，过滤，上机。

五、注意事项

1.整个过程中须将细胞样本置于冰上，确保细胞活力。

2.根据实际情况调整离心参数，确保大部分细胞能离心至管底，保证细胞活力。

3.加入封闭剂、死活染料及抗体后均需进行轻微涡旋，以确保细胞与试剂均匀接触。

3.制备完单细胞悬液后尽快进行染色和上机，避免因细胞活力下降导致的结果偏差。