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Western Blot 操作

赵松 |  2022-11-23  | DOI: 10.21769/BioProtoc.v1087
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视频简介Western Blot实验如今走进千万家实验室,也是非常常见的实验,但是在做的过程中,有非常多的细节以及问题,因此录此视频将个人做WB实验的一些细节进行了详细展示。
  • 视频介绍

一、视频摘要
Western Blot目前已经走进绝大多数实验室,也称为蛋白质免疫印迹,在检测蛋白表达方面发挥着极其重要的作用。Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳法,被检测的蛋白被对应的一抗体所识别,用标记的二抗进行孵育后,利用底物显色或者放射自显影显色。该视频只囊括了从煮样跑胶到一抗孵育相关步骤,由于每个人操作习惯的不同可能存在一定的差异,实验视频仅供参考。

二、关键词

Western Blot、蛋白、聚丙烯酰胺凝胶电泳


三、实验样品信息,试剂、耗材或仪器

1.样品信息

2.试剂、耗材和仪器

蛋白样品、蛋白Marker、电泳仪、电泳凝胶、无水甲醇、电泳液、转膜液、电泳槽、转膜槽、电泳仪、摇床、PVDF膜、脱脂奶粉、转膜夹子、海绵垫、滤纸。

四、实验操作

1.蛋白样品煮样后进行离心;

2.将胶板与电泳槽进行组装后加入合适的电泳液;

3.将蛋白样品上样并点上蛋白marker;

4.80 V恒压进行电泳,待蛋白样品进入分离胶后将电压调至120 V;

5.待蛋白样品分离至合适位置(参考蛋白Marker位置)进行转膜;

6.转膜操作参考视频转膜环节;

7.转膜按照250 mA恒流进行转膜,转膜时间根据蛋白进行确定;

8.转膜结束后用10%脱脂奶粉进行膜的封闭,室温封闭45 min;

9.封闭结束后用5%脱脂奶配制一抗,然后裁膜进行抗体孵育;

10.一抗孵育:室温1 h,四度过夜。

五、注意事项

1.电泳和转膜时切忌注意正负极;

2.转膜时对上样的第一个泳道做好标记;

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