一、视频摘要
原理：菌落PCR（colony
PCR）是一种快速、高通量筛选目的基因片段是否存在的方法，操作简单方便。筛选目的是为了得到含目的基因片段的菌株，方便进行测序等后续实验，提高效率。通过琼脂糖凝胶电泳，对比目的条带的长度筛选出含目的基因的菌株。分枝杆菌细胞壁厚实，需要进行一些处理使得菌体裂解，从而释放其DNA。
二、关键词
分枝杆菌 PCR
三、实验样品信息，试剂、耗材或仪器
1. 样品信息
2. 试剂和耗材
试剂：
LB液体培养基：胰蛋白胨、酵母提取物、氯化钠
TIANGENE 凝胶回收试剂盒的EB
buffer
TAKARA
Prime STAR GXL
3. 仪器和软件
仪器：
恒温金属浴 TUS-200P
瑞江台式高速离心机 RJ-TGL-14M
迷你离心机 JC-4K
凝胶成像仪 Tanon
1600B
基因扩增仪 Long
gene T30
四、实验操作
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取菌液：先从LB
agar抗性平板上挑取新金分枝杆菌单克隆，加入到30mL
LB抗性培养基，培养3-4天，取1mL的菌液，尽可能多取到菌体。
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制备模板：1mL菌液离心12000r/min
1min，弃上清，加EB
buffer 200μL，高温煮菌10min，取2μL作为模板（尽量取到菌体）
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配制菌落PCR的体系：
在冰盒上配制体系：
50μL体系（可用于5个单克隆菌株的验证，其他体系按比例增减）
dNTP
Mix 4 μL
引物F
0.3 μL
引物R
0.3 μL
GXL
2 μL
10×
buffer 5 μL
ddH2O
28.4 μL
模板 2μL×5
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放入基因扩增仪
将样品涡旋振荡，离心。确保体系里没有气泡，放入基因扩增仪，设置程序（根据目标条带长度调整）
参考程序：98℃预变性3min，98℃变性10
s，60℃退火15s，68℃延伸3min，30个循化
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跑琼脂糖凝胶电泳：
样品反应结束后，加10×loading
buffer 终止反应，样品，Marker和ddH2O（阴性对照）分别加入到琼脂糖凝胶的样品孔，跑胶20
min，凝胶成像仪观察结果，根据目标条带长度初步确定阳性菌株。
五、注意事项
菌落PCR是初步验证阳性菌株的一个方法，为避免假阳性应该多方面去验证。
六、结果分析（可选）
七、参考文献（可选）
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