一、视频摘要
本实验采用碱裂解法裂解细胞，根据离心吸附柱在高盐状态下特异性地结合溶液中的DNA的原理特异性提取质粒DNA。
离心吸附柱中采用的硅基质材料能高效、专一地吸附DNA，可最大限度去除杂质蛋白及细胞中其他有机化合物。提取的质粒DNA可适用于各种常规操作，包括酶切、PCR、测序、连接和转化等试验。
二、关键词
质粒、DNA提取、特异性结合
三、实验样品信息，试剂、耗材或仪器
1.样品信息
2. 试剂和耗材
3. 仪器和软件
恒温摇床、台式微量离心机、凝胶成像系统、电泳仪、涡旋振荡器
四、实验操作
1、取1-5mL细菌培养物，12000rpm离心1min，尽量吸除上清（菌液较多时可以通过多次离心将菌体沉淀收集到一个离心管中）。
2、向留有菌体沉淀的离心管中加入250μL溶液Ⅰ(请先检查是否已加入RNaseA），使用移液器或旋涡振荡器彻底悬浮细菌细胞沉淀。注意：如果菌块未彻底混匀，会影响裂解导致质粒提取量和纯度偏低。
3、向离心管中加入250μL溶液Ⅱ，温和地上下翻转6-8次使菌体充分裂解。注意：混匀一定要温和，以免污染细菌基因组DNA，此时菌液应变得清亮粘稠，作用时间不要超过5
min，以免质粒受到破坏。
4、向离心管中加入350μL溶液Ⅲ，立即温和地上下翻转6-8次，充分混匀，此时会出现白色絮状沉淀。12000rpm离心10
min，用移液器小心地将上清转移到另一个干净的离心管中，尽量不要吸出沉淀。注意：溶液Ⅲ加入后应立即混合，避免产生局部沉淀。如果上清中还有微小白色沉淀，可再次离心后取上清。
5、将上一步所得上清液加入吸附柱中（吸附柱加入收集管中），室温放置2min，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
6、向吸附柱中加入600μL漂洗液Ⅰ(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12000rpm离心1min，弃废液，将吸附柱放入收集管中。
7、向吸附柱中加入700μL漂洗液Ⅱ(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12000rpm离心1min，弃废液，将吸附柱放入收集管中。
8、向吸附柱中加入500μL漂洗液Ⅱ，12000rpm离心1min，弃废液，将吸附柱放入收集管中。
9、12000rpm离心2min，将吸附柱敞口置于室温或50℃温箱放置数分钟，目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除，否则漂洗液中的乙醇会影响后续的实验如酶切、PCR等。
10、将吸附柱放入一个干净的离心管中，向吸附膜中央悬空滴加50-200μL经65℃水浴预热的洗脱液，室温放置2min，12000rpm离心1min。
11、为了增加质粒的回收效率，可将得到的洗脱液重新加入吸附柱中，室温放置2min，12000rpm离心1min。
五、注意事项
1、使用前请先检查溶液Ⅱ和溶液Ⅲ是否出现混浊，如有混浊现象，可在37℃水浴中加热几分钟，待溶液恢复澄清后再使用。溶液Ⅱ、溶液Ⅲ、漂洗液Ⅰ和漂洗液Ⅱ使用后应立即拧紧盖子。
2、洗脱缓冲液体积不应少于50μL，体积过小影响回收效率;洗脱液的pH值对洗脱效率也有影晌，若需要用水做洗脱液应保证其pH值在8.0左右(可用NaOH将水的pH值调至此范围)，pH值低于7.
0会降低洗脱效率，DNA产物应保存在-20℃，以防DNA降解。
3、
如果所提质粒为低拷贝质粒或大于10kb的大质粒，应加大菌体使用量，使用5-10mL过夜培养物，同时按照比例增加溶液Ⅰ、溶液Ⅱ和溶液Ⅲ的用量，吸附和洗脱时可以适当的延长时间，以增加提取效率。
4、DNA浓度及纯度检测：得到的质粒DNA纯度与样品保存时间、操作过程中的剪切力等因素有关。得到的DNA可用琼脂糖疑胶电泳和紫外分光光度计检测浓度与纯度。DNA应在OD260处有显著吸收峰，OD260值为1相当于大约50ug/mL双链DNA、40ug/mL单链DNA。OD260/OD280比值应为1.7-1.9，如果洗脱时不使用洗脱缓冲液，而使用去离子水，比值会偏低，因为pH值和离子存在会影响吸光值，但并不表示纯度低。
六、结果分析（可选）
七、参考文献（可选）
[1]
Deguang Wu,Xuewu Guo,Jun Lu,et al. A rapid and efficient one-step
site-directed deletion, insertion, and substitution mutagenesis
protocol. Analytical Biochemistry. March 2013;254-258. (IF 2.275)
[2]
Jian Dong,Guanglu Wang,Cuiying Zhang,et al. A two-step integration
method for seamLess gene deletion in baker’s yeast. Analytical
Biochemistry. August 2013;30-36. (IF 2.275)
[3]
Haigang Tan,Jian Dong,Guanglu Wang,et al. Enhanced freeze tolerance
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gene (TPS1) and deleted trehalase genes in frozen dough. Journal of
Industrial Microbiology & Biotechnology. August 2014;41.
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