一、视频摘要
光学显微镜受制于光线衍射效应,存在分辨率极限。长久以来,生物大分子的精细结构,只能通过电子显微镜观察。而电子显微镜技术则存在样本制备复杂,成本昂贵等问题。通过超微结构扩张显微技术(Ultrastructure expansion microscopy,U-ExM),我们使用物理方法扩大细胞内生物大分子之间的距离,同时结合免疫标记技术,可在光学显微镜下实现对微管、中心粒、线粒体等多种生物大分子复合物的超微结构观察。
二、关键词
膨胀显微镜技术 超微结构 微管 中心体
三、实验样品信息,试剂、耗材或仪器
1. 试剂和耗材
试剂:丙烯酰胺,甲醛,38%丙烯酸钠,亚甲基双丙烯酰胺,四甲基乙二胺,10%过硫酸铵
耗材:细胞爬片,24孔板,弯头镊,刀片,双凹槽载玻片
2. 仪器和软件
Zeiss LSM980+ Airyscan2
四、实验操作
1. 爬片处理:准备24孔板,无水乙醇500μL浸没爬片30min。弃无水乙醇,0.01mg/mL poly-D-lysine 500μL浸没爬片20-30min。(前两步可提前1天处理,放置4℃即可)
2. 固定样品:4%PFA 重悬样品,水平转子离心机,2000-3000rpm,10min,升降速3-4。
3. 交联:弃固定液,加入交联液:PBS—912μL;AA—50μL;FA—38μL(如需减少用量,按比例减少即可)。37℃培养箱,交联5小时,若时间紧凑可交联过夜。
4. 凝胶:配制凝胶液(SA 20 μL,AA 10 μL,Bis-AA 2 μL, 10% PBS 4 μL,10% TEMED 2 μL,10% AP 2 μL),挑出爬片,用擦镜纸吸去爬片边缘水渍。吸取30μL凝胶液在平整的台面,将爬片的细胞一面面对凝胶液缓缓放下,避免气泡。冰上放置5min后,37℃培养箱放置1h。
5. 将已经凝胶好的爬片用尖头镊轻轻挑起,凝胶面向上放入6孔板或者35mm培养皿,加入变性液(10% SDS 57.14 mL,5M NaCl 4 mL,Tris-Base 0.6g溶于10mL超纯水,超纯水 补齐至100mL)浸没爬片,摇床上充分浸泡15min凝胶此时应和爬片脱落且稍微扩大。(如未脱落,可用枪头轻轻剥离)将脱落的凝胶用蓝枪头(建议不用尖头或者非塑料材质,容易破坏凝胶)挑起转移至1.5mL EP管,加入变性液,浸没凝胶。95℃,1-1.5小时,变性。
6. 第一轮扩张:弃变性液,准备9cm培养皿,其中加入一半体积的超纯水,用蓝枪头将凝胶转移至9cm盘。摇床15min,换水,继续摇床15min。(或者一直摇床30min)换水,室温放置过夜。
7. 孵育一抗和二抗:9cm盘弃水,加入PBS,10min,重复两次。此时凝胶应缩回未扩张前的大小,准备2%BSA,稀释一抗1:400/1:500),室温2h。一抗结束,室温孵育二抗,室温2h。
8. 第二轮扩张:凝胶加水室温放置过夜,进行第二轮扩张。
切胶和成像:将凝胶切成5mm×5mm大小置于双凹槽载玻片中,盖玻片封片后,使用Zeiss LSM980+ Airyscan2拍摄成像。
五、注意事项
1. 配制凝胶液时所有物品均需预冷,整个过程冰上操作。
2. 变性时间需严格控制,时间过长样品信号不连续。
3. 凝胶样品最好现制现用,放置时间不超过3天,否则凝胶容易脱水皱缩。
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