一、视频摘要
光学显微镜受制于光线衍射效应，存在分辨率极限。长久以来，生物大分子的精细结构，只能通过电子显微镜观察。而电子显微镜技术则存在样本制备复杂，成本昂贵等问题。通过超微结构扩张显微技术（Ultrastructure expansion microscopy，U-ExM），我们使用物理方法扩大细胞内生物大分子之间的距离，同时结合免疫标记技术，可在光学显微镜下实现对微管、中心粒、线粒体等多种生物大分子复合物的超微结构观察。
二、关键词
膨胀显微镜技术 超微结构 微管 中心体
三、实验样品信息，试剂、耗材或仪器
1. 试剂和耗材
试剂：丙烯酰胺，甲醛，38%丙烯酸钠，亚甲基双丙烯酰胺，四甲基乙二胺，10%过硫酸铵
耗材：细胞爬片，24孔板，弯头镊，刀片，双凹槽载玻片
2. 仪器和软件
Zeiss LSM980+ Airyscan2
四、实验操作
1. 爬片处理：准备24孔板，无水乙醇500μL浸没爬片30min。弃无水乙醇，0.01mg/mL poly-D-lysine 500μL浸没爬片20-30min。（前两步可提前1天处理，放置4℃即可）
2. 固定样品：4%PFA 重悬样品，水平转子离心机，2000-3000rpm，10min，升降速3-4。
3. 交联：弃固定液，加入交联液：PBS—912μL；AA—50μL；FA—38μL（如需减少用量，按比例减少即可）。37℃培养箱，交联5小时，若时间紧凑可交联过夜。
4. 凝胶：配制凝胶液（SA 20 μL，AA 10 μL，Bis-AA 2 μL， 10% PBS 4 μL，10% TEMED 2 μL，10% AP 2 μL），挑出爬片，用擦镜纸吸去爬片边缘水渍。吸取30μL凝胶液在平整的台面，将爬片的细胞一面面对凝胶液缓缓放下，避免气泡。冰上放置5min后，37℃培养箱放置1h。
5. 将已经凝胶好的爬片用尖头镊轻轻挑起，凝胶面向上放入6孔板或者35mm培养皿，加入变性液（10% SDS 57.14 mL，5M NaCl 4 mL，Tris-Base 0.6g溶于10mL超纯水，超纯水 补齐至100mL）浸没爬片，摇床上充分浸泡15min凝胶此时应和爬片脱落且稍微扩大。（如未脱落，可用枪头轻轻剥离）将脱落的凝胶用蓝枪头（建议不用尖头或者非塑料材质，容易破坏凝胶）挑起转移至1.5mL EP管，加入变性液，浸没凝胶。95℃，1-1.5小时，变性。
6. 第一轮扩张：弃变性液，准备9cm培养皿，其中加入一半体积的超纯水，用蓝枪头将凝胶转移至9cm盘。摇床15min，换水，继续摇床15min。（或者一直摇床30min）换水，室温放置过夜。
7. 孵育一抗和二抗：9cm盘弃水，加入PBS，10min，重复两次。此时凝胶应缩回未扩张前的大小，准备2%BSA，稀释一抗1：400/1：500），室温2h。一抗结束，室温孵育二抗，室温2h。
8. 第二轮扩张：凝胶加水室温放置过夜，进行第二轮扩张。
切胶和成像：将凝胶切成5mm×5mm大小置于双凹槽载玻片中，盖玻片封片后，使用Zeiss LSM980+ Airyscan2拍摄成像。
五、注意事项
1. 配制凝胶液时所有物品均需预冷，整个过程冰上操作。
2. 变性时间需严格控制，时间过长样品信号不连续。
3. 凝胶样品最好现制现用，放置时间不超过3天，否则凝胶容易脱水皱缩。
声明：该视频作品仅代表作者观点，用于共享科学技术。内容仅供大家参考，不代表本站立场。