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截短体真核表达质粒的构建

那迪娜·帕尔哈提, 张鹏善 和 黄陈 |  2023-12-08  | DOI: 10.21769/BioProtoc.v1190
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视频简介蛋白质截短体的构建实验方法
  • 视频介绍

一、视频摘要

目的:

1. 研究蛋白质功能:通过构建蛋白质截短体,可以研究蛋白质翻译后的修饰,蛋白质之间的相互作用等,从而深入了解蛋白质的生物学功能。

2. 药物开发:许多药物都是通过作用于蛋白质来发挥疗效的,通过构建蛋白质截短体,可以筛选出具有特定功能的药物靶点。

3. 蛋白质工程:蛋白质截短体构建可以用于改造现有的蛋白质,使其具有更强的生物学活性和稳定性。

 

二、关键词

蛋白质截短体,真核质粒

 

二、实验样品信息,试剂、耗材或仪器

1. 样品信息

 

2. 试剂和耗材

1. 试剂:

快捷型琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒II(离心柱型) Bioteke

DpnI NEB

KOD- Plus TOYOBO

DNA抽提试剂盒 UE-MN-P-500

 

2.    耗材:

1.5 ml Ep

0.2 ml PCR

15 ml离心管

LB琼脂平板

 

3. 仪器和软件

高速离心机

PCR

37℃培养箱

金属浴

微量移液器

 

四、实验操作

①根据目的蛋白结构域设计截短体引物

②目的截短体质粒的扩增:

使用KOD-Plus酶对目的质粒进行扩增,反应各组分解冻后请充分摇匀,使用后放于-20℃储存。推荐的反应体系如下:

组分

体积

dNTPs

5ul

MgSO4

2ul

KODPlus Buffer

5ul

KOD-Plus

1ul

目的蛋白全长质粒

200ng

截短体引物(F+R

(20 umol)1ul

ddH2O

add to 50ul

每种突变体配置两管,两管设置不同的退火温度。

 

 

 

 

 

第一轮PCR

 

循环次数

94     3min

1

94     15s

10

 

Tm -2/4   30s

68   1 min/kb

68     10min

1

4     

1

 

第二轮PCR

 

循环次数

94     3min

1

94     15s

18

68     30s

68     1 min/kb

68     10min

1

4     

1

 

③产物纯化:

*参考快捷型琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒II(离心柱型) Bioteke protocol

1. 100ul扩增产物(同一突变的两管合一)+300ul 溶胶/结合液体DB

2. 加至微量吸附柱中,静置 1min 12000rpm 1min

3. 加入700ul WB漂洗液(已加乙醇) 12000rpm 1min

4. 加入500ul WB漂洗液(已加乙醇) 12000rpm 1min

5. 空吸附柱,12000rpm 2min

6. 吸附柱放入干净的新Ep管中,ddH2O事先预热至65℃,加入24 ul ddH2O12000rpm 1min(可将离心下来的液体再次加至吸附柱中,再次离心)

④浓度测定

DpnI消化去模板:

因产物中含有原始模板质粒,为了防止其在转化后造成假阳性干扰,在后续转化前进行DpnI消化。

组分

体积

纯化后产物

22ul

DpnI 

1.5 ul

Buffer

2.6 ul

⑥转化、涂板、摇菌、小抽、测序与验证

 

五、注意事项

PCR体系配置时需注意:在冰上操作,先加体积大的溶液,需注意kODPlus酶必须加在kODPlusBuffer之后,若有不同的突变体需构建则可以将除模板与引之外的体系先配制成,配制完毕后再次弹匀,并瞬时离心。PCR的具体退火温度以及循环次数可根据自己的实验需求计算设计或探索。

 

六、结果分析

测序后续可转染HEK293T细胞,western blot检验截短体蛋白的表达。

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