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500kd大分子蛋白的电泳及转膜方法

张艳 |  2023-12-08  | DOI: 10.21769/BioProtoc.v1202
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视频简介对于大分子量蛋白,大家通常会使用4-6%低浓度的tris-甘氨酸聚丙烯酰胺凝胶进行电泳,但是该体系耗时非常长。除此之外,还可以选择tris-乙酸凝胶电泳,该体系因其独特的缓冲液配方可在电泳过程中维持较低的 pH,从而可以高效地分离大分子量蛋白质。
我的目标蛋白快接近500kd,用tris-甘氨酸电泳需要200分钟,摸到合适的条件结果也还算稳定。后来换了3-8%tris-乙酸凝胶后电泳最多60min,就能很好的分离大蛋白且结果非常好,过程中也完全不会产热。
更早之前,我用的是tris-bis凝胶体系,不推荐使用,跑四个小时也分离不出来。
国内小伙伴大多数用的都是bio-rad电泳槽,此次演示实验中用的Thermo预制胶是不适配的,可以购买碧云天,效果差一些,电泳过程注意降温。
  • 视频介绍

一、视频摘要

Western blot(也称为蛋白质免疫印迹)是一种常用于研究中分离和鉴定蛋白质的技术。它利用 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS-PAGE) 来分离指定样品中包含的各种蛋白质,然后将分离的蛋白质转移到硝酸纤维素或 PVDF 膜上,接下来将膜与对感目标蛋白质的特异抗体一起孵育。在洗膜过程中,未结合的抗体被洗掉,只留下与目标蛋白质结合的抗体,最后通过显影胶片或荧光扫描来检测结合的抗体。

 

二、关键词

大分子量蛋白、western blotSDS-PAGE

 

三、实验样品信息,试剂、耗材或仪器

1. 样品信息

示例:脑组织蛋白样本

 

2. 试剂和耗材

NuPAGE LDS 样品缓冲液 (4X)  #NP0007

NuPAGE Tris-乙酸 SDS 电泳缓冲液 (20X) #LA0041

NuPAGE 样品还原剂 (10X) #NP0009

NuPAGE 3-8%Tris-乙酸,1.01.5 mm#EA0375BOX

protein ladder #LC5699

10x Tris/Glycine Buffer for Western Blots and Native Gels #1610734

甲醇、0.2um PVDF膜、海绵垫、滤纸

 

3. 仪器和软件

BIO-RAD Mini-PROTEAN® Tetra 电泳槽

PowerPac 基础电泳仪电源

 

 

四、实验操作

1.煮蛋白:蛋白裂解液加入合适比例的loading buffer70℃加热10分钟。

2.加样:按照顺序依次加入marker及样本

3.电泳:160V60min

4.转膜:75V恒压;150min

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