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小鼠原代肝星状细胞分离

胡立伟, 袁德龙 和 铁猛 |  2023-12-08  | DOI: 10.21769/BioProtoc.v1237
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视频简介该视频将为大家介绍小鼠原代肝星状细胞分离的操作。包括肝脏灌注消化和离心分离两大部分,上半部分着重讲解肝脏肝门静脉的进针和消化过程;下半部分重点在于不同转速的离心。希望对大家在星状细胞分离实验上有所帮助。
  • 视频介绍

一、视频摘要

肝星状细胞是肝脏特有的一种非实质细胞,约占肝脏细胞总数的8%-13%。为单层的贴壁生长型细胞,细胞呈星形,纺锤形,细胞质内含较多脂滴,亦称肝贮脂细胞。肝星状细胞位于肝窦内皮细胞(SEC)和肝细胞之间Disse腔,是细胞外基质(ECM)的主要来源细胞。1在肝脏纤维化发生发展中起到关键作用。2为方便在肝脏纤维化过程中肝星状细胞激活的相关研究,本视频将为大家介绍小鼠原代肝星状细胞分离的实验操作。

 

二、关键词

肝星状细胞 原代 分离

 

三、实验样品信息,试剂、耗材或仪器

1. 样品信息

C57BL/6J小鼠

 

2. 试剂和耗材

2.1 Perfusion BufferPH7.4

Reagent

Final Concentration

Stock Concentration

Volumeml

HBSS no Ca2+,no Mg2+, no phenol red

 

 

487

EDTA

0.5mM

0.5M

0.5

HEPES

25Mm

1M

12.5

Total

 

 

500

 

2.2 Digestion Buffer

Reagent

Final Concentration

Stock Concentration

Volumeml

HBSS Ca2+, Mg2+,  phenol red

 

 

487.5

HEPES

25Mm

1M

12.5

Total

 

 

500

使用前,collagenase IV 100mg+200ml digestion buffer,可分装保存,约消化3-4只小鼠。

 

2.3 Plating medium

Reagent

Final Concentration

Stock Concentration

Volumeml

DMEM low glucose

 

 

470

FBS

5%

100%

25

Penicillin-Streptomycin Solution

1%

Pen-100 units/ml

Strep-0.1 mg/ml

100%

Pen-1000 units/ml

Strep-10 mg/ml

5

Total

 

 

500

 

2.4 Nycodenz medium4.36g+15ml buffer

ADissolve 4.94g of Nycodenz in 15ml of GBSS, and place the mixture on an orbital shaker to dissolve.

B. adjust the volume to 17 ml and filter the solution through a 0.2um syringe filterPlace the solution on ice to cool down before mixing with HSC.

 

3. 仪器和软件

水浴锅;手术器械;蠕动泵等

 

四、实验操作

4.1手术前准备:

1)  perfusion buffer digestion buffer 42℃预热;

2)  蠕动泵用70%乙醇消毒5min

3)  Perfusion buffer 连接蠕动泵,排净空气;

4)  小鼠麻醉,充分暴露腹腔,关键是下腔静脉和肝门静脉;

 

4.2 小鼠肝脏灌装:灌注过程中打开加热灯

1)  从肝门静脉扎针,血管夹固定;

2)  打开蠕动泵,观察肝脏与下腔静脉变化,若二者肿胀,剪断下腔静脉(尽量远离肝脏端剪短);

3)  灌注过程中,可适当夹住下腔静脉,帮助灌注更充分;灌注到肝脏变白,大约2-3min

 

4.3 肝脏消化:

1)  短暂停止灌注,迅速将灌注管道换到消化液中;

2)  消化过程中,可适当夹住下腔静脉,帮助消化液充分进入到肝脏组织;

3)  消化到肝脏有裂纹为止,大约15-20min

4)  结束消化摘下肝脏组织,去除胆囊,置于含有消化液的50ml离心管中;

 

4.4 星状细胞分离

1)  70um滤网过滤细胞,收集细胞滤液;

2)  580g 4℃离心10min

3)  去除上清(留10ml),用GBSS buffer补充到50ml580g 4℃离心10min洗涤细胞一次;

4)  10ml上清液重悬细胞,加入10mlGBSS buffer20ml

5)  加入10ml Nycodenz medium,混匀后分装到315ml的离心管中,将管壁充分润湿;

6)  3ml注射器轻轻加入1.5ml GBSS buffer作为上层封闭液;

7)  1380g离心17min4℃without brake

8)  离心结束后细胞将分为三层,其中中间的白色层为星状细胞所在层;

9)  5ml pipette收集细胞层,并转移到新的50ml离心管中;

10) 体积补充到50ml580g离心10min at 4℃

11) 培养基重悬细胞培养,待贴壁后镜检。

 

五、注意事项

5.1  Digestion Buffer现配现用;

5.2 消化过程中,确保消化液灌流正常;

5.3 GBSS buffer 封闭时要缓慢加入;

5.4 离心分层后不要摇晃。

 

六、参考文献

 

1.              Kamm DR, McCommis KS. Hepatic stellate cells in physiology and pathology. J Physiol 2022;600(8):1825-1837. (In eng). DOI: 10.1113/jp281061.

2.              Higashi T, Friedman SL, Hoshida Y. Hepatic stellate cells as key target in liver fibrosis. Adv Drug Deliv Rev 2017;121:27-42. (In eng). DOI: 10.1016/j.addr.2017.05.007.

 

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