羊驼免疫及血清抗体效价检测

一、视频摘要
羊驼经过抗原免疫，通过体内免疫系统的作用使得抗体成熟后，采集羊驼外周血进行血清抗体效价评价是获得高亲和力纳米抗体的第一步。

本视频介绍了完成羊驼免疫及血清抗体效价检测实验所需的试剂与仪器、具体实验设计与操作过程，并对操作中的注意事项进行讨论，能够帮助血清抗体效价评价实验的学习者快速掌握技巧。

二、关键词

羊驼免疫，纳米抗体，免疫库

三、实验样品信息，试剂、耗材或仪器

1. 样品信息

羊驼外周血

2. 试剂和耗材

1.       Freund′s Adjuvant, Complete& Incomplete (F5881&F5506，SIGMA)

2.       DPBS basic (C14190500BT, Gibco)

3.       Bovine albumin (69100, PROLIANT BIOLOGICALS)

4.       Anti-Alpaca IgG(H+L) Goat antibody(HRP) (053-404-005, AlpVHHs)

5.       TMB ELISA Substrate (Highest Sensitivity) (ab171522, Abcam)

6.       450 nm Stop Solution for TMB Substrate (ab171529, Abcam)

3. 仪器和软件

Wellwash (5165040, Thermo Scientific™)

THE SPARK® MULTIMODE MICROPLATE READER (TECAN)

四、实验操作

1.       抗原配制：取200μg免疫蛋白，使用无氯、无镁的DPBS补齐至600μl;

2.       加入等体积的弗式完全佐剂（第一次免疫使用完全佐剂、后续免疫使用不完全佐剂）；

3.       4℃震荡乳化2~3h；

4.       检查乳化情况：取1滴乳化后液体，滴在水面观察，若液滴维持状态则表明乳化完全，反之乳化不完全；

5.       将乳化液体转移至无菌注射器内，为免适龄羊驼进行注射免疫；

6.       每次在羊驼颈部淋巴结附近分左右两侧皮下注射，每侧分2点注射，每点注射约0.5 mL乳化好的抗原。免疫后观察半小时确认羊驼状态良好，无不适症状。每2周免疫一次，至少进行4次免疫；

7.       每次抗原免疫前进行采血用于免疫评价，每次取5 mL血液；血液当天使用预冷25℃离心机，4000 rpm离心10分钟，分离冻存上层血清，用于后续抗体效价检测；

8.       抗原包被：ELISA板 包被浓度：1μg/ml 每孔50μl  4℃ 过夜

9.       PBSTx3, 2%BSA 封闭 2h；

10.    PBSTx5，取羊驼血清，10倍梯度稀释9个梯度，取-2~-9梯度血清于ELISA板中，室温孵育1h；

11.    PBSTx5, 加 入 Anti-Alpaca IgG(H+L) Goat antibody(HRP) [ AlpHcAbs®]，1：50000稀释，室温孵育1h；

12.    PBSTx5, 加入显色液 50μl，避光反应 30min，加入 50μl 终止液终止、

13.    酶标仪测量 OD450

五、注意事项

首先，需要注意抗原免疫过程中的乳化情况，确保充分乳化，以免影响免疫效果。

其次，对于免疫过程中的注射、采血等操作，需要保证无菌无毒，避免感染，危害实验结果和动物健康。

最重要的是，需要严格控制PBST洗板次数、二抗最佳稀释倍数等参数，确保实验的准确性和可重复性。

六、结果分析（可选）

① 羊驼在一至五次免疫后抗体效价依次增高，表明其针对抗原产生的免疫应答随免疫次数逐渐增强

② 第五次免疫后免疫效价达到105，符合建库标准，可以对羊驼进行采血分离PBMC并进行后续实验