一、视频摘要
热激法转化大肠杆菌具有操作简便、转化效率高、适用范围广、重组子稳定和细胞状态可控等优点。这些优点使得该方法在基因工程、蛋白质表达等领域得到了广泛应用。
二、关键词
热激发转化感受态细胞
三、实验样品信息，试剂、耗材或仪器
1.样品信息
大肠杆菌DH5α感受态细胞
2.试剂和耗材
1.5ml离心管、移液枪头、移液器、培养皿、涂布器、卡那霉素（100mg/ml）、大肠杆菌DH5α、连接产物、pUC19、灭菌LB培养液
3.仪器和软件
-20℃冰箱、超低温冰箱、制冰机、恒温水浴器、超净工作台、恒温摇床、小型高速离心机、恒温培养箱
四、实验操作
1.打开制冰机
2.打开水浴锅，温度设置为42℃
3.提前30min打开超净工作台，紫外消毒
4.打开摇床，温度设置为37℃，转速180转
5 取感受态细胞置于冰浴中，如需分装可将刚融化细胞悬液分装到无菌预冷的离心管中，置于冰浴中。（注意：一次转化感受态细胞的建议用量为50-100 μl，可以根据实际情况分装使用。应注意所用DNA体积不要超过感受态细胞悬液体积的十分之一。）以下实验以100 μl感受态细胞为例。
6.向感受态细胞悬液中加入连接产物或pUC19质粒（感受态细胞在刚融化时活性最大，100 μl的感受态细胞能够被1 ng超螺旋质粒DNA所饱和），轻弹混匀，在冰浴中静置30 min。
7.将离心管置于42℃水浴中放置60-90 sec，然后快速将管转移到冰浴中，使细胞冷却2-3 min，该过程不要摇动离心管。（注意：此步骤也可将离心管置于室温进行，时间不需十分准确，夏季或室温较高时，可放置5-8 min左右，如果室温较低，可延长时间至8-15 min左右。条件允许建议使用42℃热激方法。）
8.向每个离心管中加入400 μl无菌的LB培养基（不含抗生素），混匀后置于37℃摇床振荡培养60min (180 rpm)，目的是使质粒上相关的抗性标记基因表达，使菌体复苏。
9.将离心管内容物混匀，吸取100 μl已转化的感受态细胞加到含卡那的LB固体琼脂培养基上，用无菌的弯头玻棒轻轻的将细胞均匀涂开。将平板置于室温直至液体被吸收，倒置平板，37℃培养12-16 h。
五、 注意事项
1、感受态细胞应保存在-80℃，不可反复冻融，否则其转化效率将会降低。
2、实验过程中应严格无菌操作，防止其它DAN或杂菌的污染，避免为以后的筛选、鉴定带来影响。
3、转化时，转化效率与外源DNA的浓度在一定范围内成正比，但当加入的外源DNA量过多或体积过大反而会降低转化效率。转化时DNA体积要小于感受态细胞体积的十分之一。
4、 热激温度和时间要适宜不能过高或过低，以免对细胞造成损害或影响转化效果。
5、在冷却和恢复过程中，需要注意控制冷却速度和恢复时间，以避免对菌体造成过度应激或影响后续的克隆或表达实验。
6、 筛选过程中，需要注意阳性克隆的特性和稳定性，以保证目的基因的正确表达。
7、为了提高目的基因的表达水平和稳定性，可以通过调整培养温度、pH值、盐浓度等因素来优化大肠杆菌的培养条件。同时，需要注意控制细胞生长速度和质粒拷贝数，以避免对细胞造成过度应激或影响目的基因的表达。
8、转化率的计算:转化率-产生菌落的总数/铺板DNA总量。
为防止转化实验不成功，可以保留部分连接产物，以重新转化，将损失降到最低。
9、 实验进行时需要采取必要的防护措施和消毒措施，同时实验结束后要将废液和废弃物进行妥善处理。
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