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热激法转化:将连接产物转入DH5α

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视频简介细菌处于容易吸收外源DNA的状态叫感受态。转化是指质粒DNA或以它为载体构建的重组子导入细菌的过程。其原理是:在0℃下的CaCl2低渗溶液中,细菌细胞膨胀成球形。转化缓冲液中的DNA形成不易被DNA酶所降解的羟基-钙磷酸复合物,此复合物粘附于细菌细胞表面。42℃短时间热处理(热休克),可以促进细胞吸收DNA复合物。将处理后的细菌放置在非选择性培养液中保温一段时间,促使在转化过程中获得的新的表型(如Amp抗性) 得到表达。然后再涂布于含有氨苄青霉素的选择性平板上,37℃培养过夜,这样即可得到转化菌落。
  • 视频介绍

一、视频摘要

热激法转化大肠杆菌具有操作简便、转化效率高、适用范围广、重组子稳定和细胞状态可控等优点。这些优点使得该方法在基因工程、蛋白质表达等领域得到了广泛应用。

 

二、关键词

热激发转化感受态细胞

 

三、实验样品信息,试剂、耗材或仪器

1.样品信息

大肠杆菌DH5α感受态细胞

 

2.试剂和耗材

1.5ml离心管、移液枪头、移液器、培养皿、涂布器、卡那霉素(100mg/ml)、大肠杆菌DH5α、连接产物、pUC19、灭菌LB培养液

 

3.仪器和软件

-20℃冰箱、超低温冰箱、制冰机、恒温水浴器、超净工作台、恒温摇床、小型高速离心机、恒温培养箱

四、实验操作

1.打开制冰机

2.打开水浴锅,温度设置为42℃

3.提前30min打开超净工作台,紫外消毒

4.打开摇床,温度设置为37℃,转速180转

5 取感受态细胞置于冰浴中,如需分装可将刚融化细胞悬液分装到无菌预冷的离心管中,置于冰浴中。(注意:一次转化感受态细胞的建议用量为50-100 μl,可以根据实际情况分装使用。应注意所用DNA体积不要超过感受态细胞悬液体积的十分之一。)以下实验以100 μl感受态细胞为例。

6.向感受态细胞悬液中加入连接产物或pUC19质粒(感受态细胞在刚融化时活性最大,100 μl的感受态细胞能够被1 ng超螺旋质粒DNA所饱和),轻弹混匀,在冰浴中静置30 min。

7.将离心管置于42℃水浴中放置60-90 sec,然后快速将管转移到冰浴中,使细胞冷却2-3 min,该过程不要摇动离心管。(注意:此步骤也可将离心管置于室温进行,时间不需十分准确,夏季或室温较高时,可放置5-8 min左右,如果室温较低,可延长时间至8-15 min左右。条件允许建议使用42℃热激方法。)

8.向每个离心管中加入400 μl无菌的LB培养基(不含抗生素),混匀后置于37℃摇床振荡培养60min (180 rpm),目的是使质粒上相关的抗性标记基因表达,使菌体复苏。

9.将离心管内容物混匀,吸取100 μl已转化的感受态细胞加到含卡那的LB固体琼脂培养基上,用无菌的弯头玻棒轻轻的将细胞均匀涂开。将平板置于室温直至液体被吸收,倒置平板,37℃培养12-16 h。

 

五、 注意事项

1、感受态细胞应保存在-80℃,不可反复冻融,否则其转化效率将会降低。

2、实验过程中应严格无菌操作,防止其它DAN或杂菌的污染,避免为以后的筛选、鉴定带来影响。

3、转化时,转化效率与外源DNA的浓度在一定范围内成正比,但当加入的外源DNA量过多或体积过大反而会降低转化效率。转化时DNA体积要小于感受态细胞体积的十分之一。

4、 热激温度和时间要适宜不能过高或过低,以免对细胞造成损害或影响转化效果。

5、在冷却和恢复过程中,需要注意控制冷却速度和恢复时间,以避免对菌体造成过度应激或影响后续的克隆或表达实验。

6、 筛选过程中,需要注意阳性克隆的特性和稳定性,以保证目的基因的正确表达。

7、为了提高目的基因的表达水平和稳定性,可以通过调整培养温度、pH值、盐浓度等因素来优化大肠杆菌的培养条件。同时,需要注意控制细胞生长速度和质粒拷贝数,以避免对细胞造成过度应激或影响目的基因的表达。

8、转化率的计算:转化率-产生菌落的总数/铺板DNA总量。

为防止转化实验不成功,可以保留部分连接产物,以重新转化,将损失降到最低。

9、 实验进行时需要采取必要的防护措施和消毒措施,同时实验结束后要将废液和废弃物进行妥善处理。

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