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DNA纯化、目的基因与质粒载体的酶切

黄金玉 |  2023-12-08  | DOI: 10.21769/BioProtoc.v1262
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视频简介染色体DNA比质粒DNA分子大得多,且染色体DNA为线状分子,
而质粒DNA为共价闭合环状分子;
当用碱处理DNA溶液时,线状染色体DNA容易发生变性,共价闭
环的质粒DNA在回到中性pH时即恢复其天然构象;
变性染色体DNA片段与变性蛋白质和细胞碎片结合形成沉淀, 而
复性的超螺旋质粒DNA分子则以溶解状态存在液相中,从而可通过离心
将两者分开。
  • 视频介绍

一、视频摘要

染色体DNA比质粒DNA分子大得多,且染色体DNA为线状分子,而质粒DNA为共价闭合环状分子;当用碱处理DNA溶液时,线状染色体DNA容易发生变性,共价闭环的质粒DNA在回到中性pH时即恢复其天然构象;变性染色体DNA片段与变性蛋白质和细胞碎片结合形成沉淀, 而复性的超螺旋质粒DNA分子则以溶解状态存在液相中,从而可通过离心将两者分开。

 

二、关键词

DNA纯化、质粒、酶切、碱裂解法

 

三、实验样品信息,试剂、耗材或仪器

1. 样品信息

含重组质粒的菌株

 

2. 试剂和耗材

1.5mL离心管、离心管架、提质粒试剂盒、ddH20

 

3. 仪器和软件

台式高速离心机、移液器、低温冰箱、恒温摇床等

 

四、实验操作

(一)DNA纯化用量(单位:μL

1.向离心吸附柱中加入500μL Buffer BL,静置1min,室温下12000rm离心1min,弃收集管中的废液,将离心吸附柱重新放回收集管中(请使用当天处理过的吸附柱)。

2.按每1μL DNA样品加入1μL Buffer MB(膜结合液)的比例(DNA样品:Buffer MB=11)加入Buffer MB,混匀后转移到离心吸附柱内(带有收集管),室温静置1min,室温下12000rpm离心1min,弃除收集管中的废液,将离心吸附柱重新插回收集管中;

3.加入600μL Buffer MW(膜漂洗液,已加入无水乙醇)于离心吸附柱中,室温下12000rpm离心30s,弃除收集管中的废液,将离心吸附柱重新插回收集管中;

4.重复操作步骤3一次。

5.室温下12000rpm空离2min,弃除收集管。

6.将吸附柱置于1.5mL离心管中,加入50μL ddH2O(第二次纯化时,加入30μL ddH2O)至吸附柱中央,室温静置1min12000rpm离心1min,弃去吸附柱,获得的DNA片段可直接用于后续反应或于-20℃长期保存。

 

(二)质粒DNA与目的基因片段的酶切

1.1.5mL离心管中,按照下表加入试剂(单位:μL

2.混匀,离心将反应液甩至管底。37℃PCR仪或恒温培养箱)保温1~2h进行酶切反应;

3.酶切反应结束后进行纯化(参照本实验步骤一)。

1)柱平衡:准备离心吸附柱,加入500μL BL平衡,静止1min12000rpm离心1min,弃掉废液。

2 DNA结合、清洗、再次清洗、洗脱。

 

(三)质粒DNA与目的基因片段的连接

1.200μL的离心管按下表加入试剂;

2.混匀后离心,将溶液甩至管底;

3.置于已调好温度的16℃ PCR仪中;

4.保温4h后取出做转化或放置4℃保存。

 

五、注意事项

提不出质粒或质粒提取量很少:

1)菌体中无质粒:有些质粒本身不能在某些菌种中安稳存在,经屡次摇菌后可能导致质粒丢失。

2)菌种老化:假如是甘油菌,主张涂布平板培育后,重新挑选菌落后再进行液体培育。

3)质粒拷贝数低:某些质粒归于低仿制类型,也会引起质粒提取量低,尽量换用相同功用的高仿制质粒,或许一同添加菌体和试剂的运用量。

4)碱裂解不充分:质粒提取过程中,并非菌体量越高提取量越高,运用过多的菌液,会导致菌体裂解不充分,可适当添加下流提取试剂的运用量或减少菌液用量。
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