一、视频摘要
染色体DNA比质粒DNA分子大得多，且染色体DNA为线状分子，而质粒DNA为共价闭合环状分子；当用碱处理DNA溶液时，线状染色体DNA容易发生变性，共价闭环的质粒DNA在回到中性pH时即恢复其天然构象；变性染色体DNA片段与变性蛋白质和细胞碎片结合形成沉淀， 而复性的超螺旋质粒DNA分子则以溶解状态存在液相中，从而可通过离心将两者分开。
二、关键词
DNA纯化、质粒、酶切、碱裂解法
三、实验样品信息，试剂、耗材或仪器
1. 样品信息
含重组质粒的菌株
2. 试剂和耗材
1.5mL离心管、离心管架、提质粒试剂盒、ddH20
3. 仪器和软件
台式高速离心机、移液器、低温冰箱、恒温摇床等
四、实验操作
（一）DNA纯化用量（单位：μL）
1.向离心吸附柱中加入500μL Buffer BL，静置1min，室温下12000rm离心1min，弃收集管中的废液，将离心吸附柱重新放回收集管中（请使用当天处理过的吸附柱）。
2.按每1μL DNA样品加入1μL Buffer MB（膜结合液）的比例（DNA样品：Buffer MB=1：1）加入Buffer MB，混匀后转移到离心吸附柱内（带有收集管），室温静置1min，室温下12000rpm离心1min，弃除收集管中的废液，将离心吸附柱重新插回收集管中；
3.加入600μL Buffer MW（膜漂洗液，已加入无水乙醇）于离心吸附柱中，室温下12000rpm离心30s，弃除收集管中的废液，将离心吸附柱重新插回收集管中；
4.重复操作步骤3一次。
5.室温下12000rpm空离2min，弃除收集管。
6.将吸附柱置于1.5mL离心管中，加入50μL ddH2O（第二次纯化时，加入30μL ddH2O）至吸附柱中央，室温静置1min，12000rpm离心1min，弃去吸附柱，获得的DNA片段可直接用于后续反应或于-20℃长期保存。
（二）质粒DNA与目的基因片段的酶切
1.在1.5mL离心管中，按照下表加入试剂（单位：μL）
2.混匀，离心将反应液甩至管底。37℃（PCR仪或恒温培养箱）保温1~2h进行酶切反应；
3.酶切反应结束后进行纯化（参照本实验步骤一）。
（1）柱平衡：准备离心吸附柱，加入500μL BL平衡，静止1min，12000rpm离心1min，弃掉废液。
（2） DNA结合、清洗、再次清洗、洗脱。
（三）质粒DNA与目的基因片段的连接
1.取200μL的离心管按下表加入试剂；
2.混匀后离心，将溶液甩至管底；
3.置于已调好温度的16℃ PCR仪中；
4.保温4h后取出做转化或放置4℃保存。
五、注意事项
提不出质粒或质粒提取量很少：
（1）菌体中无质粒：有些质粒本身不能在某些菌种中安稳存在，经屡次摇菌后可能导致质粒丢失。
（2）菌种老化：假如是甘油菌，主张涂布平板培育后，重新挑选菌落后再进行液体培育。
（3）质粒拷贝数低：某些质粒归于低仿制类型，也会引起质粒提取量低，尽量换用相同功用的高仿制质粒，或许一同添加菌体和试剂的运用量。
（4）碱裂解不充分：质粒提取过程中，并非菌体量越高提取量越高，运用过多的菌液，会导致菌体裂解不充分，可适当添加下流提取试剂的运用量或减少菌液用量。
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