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Ames试验大鼠肝S9生物学活性鉴定试验

胡彩珍 |  2023-12-08  | DOI: 10.21769/BioProtoc.v1292
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视频简介大鼠肝S9生物学活性鉴定作为Ames试验体系中,重要的试剂质控。主要包括验证商品化的大鼠肝S9无菌测试,和10% S9混合液生物学活性验证测试。 S9混合液包含磷酸盐缓冲液(0.2mol/L),KCl(1.65mol/L),MgCl2·6H2O(0.4mol/L),D-葡萄糖6-磷酸二钠盐(0.05mol/L) 1.0mL,NADP(0.025mol/L),大鼠肝S9液。整个试验的鉴定结果符合标准要求才能确保Ames试验活化代谢体系的有效性。
  • 视频介绍

一、视频摘要

大鼠肝S9生物学活性鉴定作为Ames试验体系中重要的商品化试剂质控内容,主要包括大鼠肝S9无菌测试,10% S9混合液生物学活性验证测试 S9混合液活性的鉴定结果符合标准要求才能确保Ames试验活化代谢体系的有效性。

 

二、关键词

Ames试验、S9混合液、生物学活性、 代谢活化体系

 

三、实验样品信息,试剂、耗材或仪器

1. 样品信息

 大鼠肝S9 来源:MOLECULAR TOXICOLOGY, INC

 

2. 试剂和耗材

试剂:

1.      鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)  TA100,来源:MOLECULAR TOXICOLOGY, INC.

2.     苯并(a)芘(BaP, 0.1mg/mL)来源:MOLECULAR TOXICOLOGY, INC.

3.      2-氨基蒽(2-AA, 0.1mg/mL)来源:MOLECULAR TOXICOLOGY, INC.

4.     磷酸盐缓冲液(0.2mol/L),KCl1.65mol/L),MgCl2·6H2O0.4mol/L),D-葡萄糖6-磷酸二钠盐(0.05mol/L),NADP0.025mol/L

5.   营养肉汤   

耗材:

1.       10mL离心管;

2.      200uL,1000uL吸头及吸液枪

3.      250mL无菌瓶

4.      雪花碎冰;

5.       废液缸;

6.      75%医用酒精

7.      试管架

 

3. 仪器和软件

1.       分析天平、 压力蒸汽灭菌器、恒温培养摇床、生物安全柜、生化培养箱、菌落计数仪

2.       IBM SPSS Statistics 24 数据编辑器

 

四、实验操作

1.      随机取2瓶购买的同批次的大鼠肝S9,准备10mLTA100菌液,4瓶灭完菌的100mL营养肉汤培养基;

2.     每瓶吸取0.1mL大鼠肝S9液到营养肉汤作为实验组,阴性对照组不添加物质,阳性对照组加入100uLTA100菌液到营养肉汤,无菌测试结束。

3.      准备S9混合液相关的试剂,氯化钾溶液、氯化镁溶液,D-葡萄糖-6-磷酸-二钠盐溶液,氧化型辅酶2溶液、磷酸盐缓冲液,按照标准配比最后混合在一起使用,进行生物学活性鉴定

4.     准备好10mLTA100菌液,阳性诱变剂一支BAP和一支2-NA1瓶氯化钠注射液,冰浴的S9混合液,15块底琼脂培养基平板,15支顶琼脂培养基试管

5.     往顶琼脂培养基里面加入100uL菌液,100uL阳性诱变剂,500uLS9液,再倾倒平板,作为试验组。对照组则添加100uL菌液、100uL氯化钠注射液和500uL S9

6.      37°C培养3天,观察生物学活性鉴定试验结果; 37°C培养5天,观察无菌试验结果。

 

五、注意事项

1.       大鼠肝S9液从-80°C取出后,全过程使用冰浴操作。

2.       D-葡萄糖-6-磷酸-二钠盐、氧化型辅酶2-20°C取出后,全过程使用冰浴操作

3.       S9混合液最后一步加入肝S9,此前的混合液使用0.45um膜过滤器除菌。

 

六、结果分析(可选)

37°C培养后,无菌试验结果,最终只有阳性对照组添加了TA100 菌液的生长,实验组跟阴性对照组无菌生长。

生物学活性试验结果,对照组生理盐水的菌落回复突变数跟添加了阳性诱变剂BAP2-NA的数据相比,统计分析后差异性显著。

说明所使用的S9混合液是满足代谢活化系统要求的,可以用于试验检测。

 

七、参考文献(可选)

GB/T 16886.3-2019 医疗器械生物学评价 3部分:遗传毒性、致癌性和生殖毒性试验。

ISO 10993-3:2014 医疗器械生物学评价 3部分:遗传毒性、致癌性和生殖毒性试验。

ISO/TR 10993-33:2015 医疗器械生物学评价 33部分:遗传毒性评价试验的指导原则—ISO 10993-3的补充。

OECD GUIDELINE FOR TESTING OF CHEMICALS Bacterial Reverse Mutation Test 471:2020

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