一、视频摘要
大鼠肝S9生物学活性鉴定作为Ames试验体系中重要的商品化试剂质控内容,主要包括大鼠肝S9无菌测试,10% S9混合液生物学活性验证测试 。S9混合液活性的鉴定结果符合标准要求才能确保Ames试验活化代谢体系的有效性。
二、关键词
Ames试验、S9混合液、生物学活性、 代谢活化体系
三、实验样品信息,试剂、耗材或仪器
1. 样品信息
大鼠肝S9 来源:MOLECULAR TOXICOLOGY, INC
2. 试剂和耗材
试剂:
1. 鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium) TA100,来源:MOLECULAR TOXICOLOGY, INC.;
2. 苯并(a)芘(BaP, 0.1mg/mL)来源:MOLECULAR TOXICOLOGY, INC.;
3. 2-氨基蒽(2-AA, 0.1mg/mL)来源:MOLECULAR TOXICOLOGY, INC.;
4. 磷酸盐缓冲液(0.2mol/L),KCl(1.65mol/L),MgCl2·6H2O(0.4mol/L),D-葡萄糖6-磷酸二钠盐(0.05mol/L),NADP(0.025mol/L);
5. 营养肉汤
耗材:
1. 10mL离心管;
2. 200uL,1000uL吸头及吸液枪;
3. 250mL无菌瓶;
4. 雪花碎冰;
5. 废液缸;
6. 75%医用酒精;
7. 试管架。
3. 仪器和软件
1. 分析天平、 压力蒸汽灭菌器、恒温培养摇床、生物安全柜、生化培养箱、菌落计数仪
2. IBM SPSS Statistics 24 数据编辑器
四、实验操作
1. 随机取2瓶购买的同批次的大鼠肝S9,准备10mLTA100菌液,4瓶灭完菌的100mL营养肉汤培养基;
2. 每瓶吸取0.1mL大鼠肝S9液到营养肉汤作为实验组,阴性对照组不添加物质,阳性对照组加入100uL的TA100菌液到营养肉汤,无菌测试结束。
3. 准备S9混合液相关的试剂,氯化钾溶液、氯化镁溶液,D-葡萄糖-6-磷酸-二钠盐溶液,氧化型辅酶2溶液、磷酸盐缓冲液,按照标准配比最后混合在一起使用,进行生物学活性鉴定;
4. 准备好10mLTA100菌液,阳性诱变剂一支BAP和一支2-NA,1瓶氯化钠注射液,冰浴的S9混合液,15块底琼脂培养基平板,15支顶琼脂培养基试管;
5. 往顶琼脂培养基里面加入100uL菌液,100uL阳性诱变剂,500uLS9液,再倾倒平板,作为试验组。对照组则添加100uL菌液、100uL氯化钠注射液和500uL S9液;
6. 37°C培养3天,观察生物学活性鉴定试验结果; 37°C培养5天,观察无菌试验结果。
五、注意事项
1. 大鼠肝S9液从-80°C取出后,全过程使用冰浴操作。
2. D-葡萄糖-6-磷酸-二钠盐、氧化型辅酶2从-20°C取出后,全过程使用冰浴操作。
3. S9混合液最后一步加入肝S9,此前的混合液使用0.45um膜过滤器除菌。
六、结果分析(可选)
37°C培养后,无菌试验结果,最终只有阳性对照组添加了TA100 菌液的生长,实验组跟阴性对照组无菌生长。
生物学活性试验结果,对照组生理盐水的菌落回复突变数跟添加了阳性诱变剂BAP或2-NA的数据相比,统计分析后差异性显著。
说明所使用的S9混合液是满足代谢活化系统要求的,可以用于试验检测。
七、参考文献(可选)
GB/T 16886.3-2019 医疗器械生物学评价 第3部分:遗传毒性、致癌性和生殖毒性试验。
ISO 10993-3:2014 医疗器械生物学评价 第3部分:遗传毒性、致癌性和生殖毒性试验。
ISO/TR 10993-33:2015 医疗器械生物学评价 第33部分:遗传毒性评价试验的指导原则—ISO 10993-3的补充。
OECD GUIDELINE FOR TESTING OF CHEMICALS Bacterial Reverse Mutation Test 471:2020
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