荧光定量PCR扩增及HRM分析

一、视频摘要

国务院印发的《中医药振兴发展重大工程实施方案》要求着力推动中医药振兴发展，中药材的正确性是保证药效、促进发展的首要前提。高分辨率熔解曲线（High Resolution Melting，HRM）是一种基于序列中单核苷酸熔解温度不同而形成不同形态熔解曲线的基因分析技术，具有速度快、通量高、闭管操作等优点。为实现中药材可视化相对定量检测，本实验利用HRM技术，以当归为例，构建当归掺杂不同比例混伪品的高分辨率熔解曲线分型库，从而推算出待测样品中混伪品的物种及其掺入比例等情况。高分辨率熔解曲线（HRM）分型库范围广、精度佳，保证可视化快速定量检测，实现定性和定量双重鉴定，拓宽了快检技术的研究范畴，为中药鉴定方法学的发展提供助力。

二、关键词

高分辨率熔解曲线（HRM）、中药鉴定、定量检测

三、实验样品信息，试剂、耗材或仪器

1. 样品信息

HRM分析方法适合中药材鉴定分析，本视频以当归和前胡为例进行了探索，视频中所用样品信息如下:

表1 中药材样品采集及鉴定结果表

2. 试剂和耗材

试剂：

（1）植物基因组DNA提取试剂盒（离心柱型）（天根生化科技（北京）有限公司，DP305）

（2）中药材当归DNA（YC01MT03）

（3）中药材前胡DNA（YC05MT03）

（4）2.5μmol的反向引物和正向引物

表2  PCR扩增及HRM分析当归及其混伪品引物设计表

（5）HRM分析试剂盒 (EvaGreen)（天根生化科技（北京）有限公司，FP210），含有：

①　2×HRM Analysis PreMix     

②　RNase-FreeddH₂O

耗材：

（1）指示胶带

（2）1.5 mL EP管

（3）0.1 mL八连管 白色，透明盖

（4）0.1 - 2.5 μL移液器及枪头

（5）0.5 - 10 μL移液器及枪头

（6）2 -20 μL移液器及枪头

（7）20 - 200 μL移液器及枪头

3. 仪器和软件

仪器：

（1）超净工作台

（2）高压灭菌锅

（3）烘干箱

（4）HWS-12型电热恒温水浴锅

（5）冷冻高速离心机

（6）复合转子离心机

（7）LightCycler 96型实时荧光定量PCR仪

四、实验操作

1、打开超净台，紫外灭菌15-30分钟后关闭紫外。

2、配置如下19管体系：

体系分装后再加DNA：稀释20倍当归0103：稀释20倍前胡0503（10：0、8：2、6：4、4: 6、2：8、0：10），各三组平行、CK1：

2X HRM Analysis PreMix       10微升

RNase-FreeddH2O            6.8微升

DGNSR引物                 0.6微升

DGNSF引物                 0.6微升

模板DNA                     2微升

（1）配制大体系：取1.5mL离心管，吸取Mix 100μl、dd H2O 68μl、正向引物6 μl、反向引物6μl加入离心管中。

（2）取四只EP管，分别标记当归与前胡的混合比例（8：2、6：4、4: 6、2：8），分别吸取8μl、6μl、4μl、2μl当归DNA溶液加入标记好的EP管中，分别吸取2μl、4μl、6μl、8μl前胡DNA溶液加入标记好的EP管中，用移液枪吹吸混匀。

（3）将配制好的体系和四支标记好的EP管放入离心机中震荡混匀。

（4）用镊子取三只八连管固定在PCR板架中，吸取18μl的体系加入八连管中，共19组，最后一组为CK。

（5）分别取当归原液、当归与前胡的8: 2、6：4、4: 6、2：8混合溶液、前胡原液各2μl，加入八连管中，每组做三组平行。用镊子夹取八连管盖盖好，用镊子压紧，在八连管两端做好标记。

（6）将八连管放入离心机中震荡混匀。

3、使用荧光定量PCR仪，用酒精棉球擦拭杀菌消毒，将八连管按顺序放入中间。操作PCR仪进行两步法PCR反应程序扩增，观察其出峰图像并进行分析。

五、注意事项

1.实验要在超净台中进行，务必防止杂菌污染；

2.使用移液枪时注意使用规范，向八连管加样时注意移液枪需垂直插入到底部；

3.镊子夹取八连管及八连管盖时注意夹侧边，盖八连管盖时顺序由下而上，防止杂菌污染；

4.配制完大体系后要注意离心混匀，当归与前胡按比例混合时要注意吹吸混匀；

5.严格要求按照实验室的管理规范进行实验操作；

6.实验结束后检测过程中所产生的废弃物应按照相关规范进行处理。

六、结果分析

根据荧光定量PCR仪扩增的出锋图像分析可以得出:不同比例混合品都有各自的Tm值和HRM曲线，且不同比例混合品的曲线都在当归与前胡间随掺伪比例呈现相应的梯度变化，实现定量检测具有可行性。