HE染色

一、视频摘要

苏木精-伊红染色法(Hematoxylin-Eosinstaining)，简称HE染色法，是病理学常规制片中最基本的染色方法。苏木精染液为碱性，主要使细胞核内的染色质与胞质内的核糖体着紫蓝色;伊红为酸性染料，主要使细胞质和细胞外基质中的成分着红色。

1、细胞核染色原理

苏木精为碱性天然染料，可使细胞核着色。细胞核内染色质的成分主要是DNA，在DNA的双螺旋结构中，两条核苷酸链上的磷酸基向外，使DNA双螺旋的外侧带负电荷，呈酸性，很容易与带正电荷的苏木精碱性燃料以离子键或氢键结合而被染色。苏木精在碱性溶液中呈蓝色，所以细胞核被染成蓝色。

2、细胞浆染色原理

细胞浆内主要成分是蛋白质，为两性化合物、细胞浆的染色与pH值有密切关系，当pH调到蛋白质等电点4.7-5.0时，胞浆对外不显电性，此时酸或碱性染料不易染色。当pH调到6.7-6.8时，大于蛋白质的等电点pH值，表现酸性电离，而带负电荷的阴离子，可被带正电荷的染料染色，现时胞核也被染色，核和胞浆难以区分。因此必须把pH调至胞浆等电点以下，在染液中加入醋酸使胞浆带正电荷（阳离子），就可被带负电荷（阴离子）的染料染色。伊红Y是一种化学合成的酸性染料，在水中离解成带负电荷的阴离子，与蛋白质的氨基正电荷（阳离子）结合而使细胞浆染色，细胞浆、红细胞、肌肉、结缔组织，嗜伊红颗料等被感染成不同程度的红色或粉红色，与蓝色的细胞核形成鲜明的对比。

3、分化作用

染色后，用某些特定的溶液将组织过多结合的染色剂脱去，这个过程称为分化作用，所用的溶液称为分化液。在HE染色中用0.5%盐酸乙醇作为分化液，因酸能破坏苏木精的醌型结构，使组织与色素分离而褪色。经苏木精染色后，必须用0.5%盐酸乙醇分化，使细胞核过多结合的苏木精染料和细胞浆吸附的苏木精染料脱去，在进行伊红染色，才能保证细胞核与细胞浆染色的分明。因此，在HE染色中分化是极为关键的一步。

4、返蓝作用

分化之后，苏木精在酸性条件下处于红色离子状态，呈红色，在碱性条件下处于蓝色离子状态，呈蓝色。组织切片经0.5%盐酸乙醇分化后呈红色或粉红色，故分化之后，立即用水除去组织切片上的酸而终止分化，再用弱碱性水（0.2%氨水）使苏木精染上的细胞核呈现蓝色，这个过程称为返蓝作用或蓝化作用。另外用自来水浸洗也可使细胞核返蓝，但所需时间较长。

本作品详细介绍了HE染色从烤片脱蜡到染色再到中性树脂封片观察的全过程，

二、关键词

HE染色、苏木精、伊红、烤片、脱蜡

三、实验样品信息，试剂、耗材或仪器

1. 试剂和耗材

试剂：Solarbio试剂盒（苏木素染液、分化液、伊红染液）、系列浓度的乙醇、二甲苯、中性树胶

耗材：待染片子、计时器、吸水纸、吸管、玻片架、染色缸、盖玻片、棉棒等

2. 仪器和软件

光学显微镜

四、实验操作

1、脱蜡：片子65℃烤片40-60分钟（确定好温度设置成功再离开），拿着二甲苯跟随至烤片处，片子在离开烘箱接着泡进二甲苯Ⅰ。二甲苯Ⅰ 12分钟，二甲苯Ⅱ 12分钟。

2、水化：100%乙醇 5分钟（两遍），95%乙醇 5分钟，85%乙醇3分钟，75%乙醇 3分钟，蒸馏水 5分钟。

使用二甲苯脱蜡，然后再使用从高到低浓度的酒精和蒸馏水进行水化，以便染料可以进入组织

3、苏木素染液染色： 肺、肝、肾染8分钟（脾染7.5分钟），自来水冲洗。

室温低于20℃，可延长苏木素染色时间。

4、分化返蓝：肺、肝、肾分化 30秒（脾 1分钟），自来水冲2次各2分钟（中间换水一次）。先于冲洗缸中接满自来水，将玻片架中的玻片区域完全浸入自来水中后，使用大水流冲击离玻片架较远的区域。

5、伊红染色：1分钟，自来水冲洗。

6、自来水浸泡4分钟。

7、脱水透明：95%乙醇Ⅰ、95%乙醇Ⅱ、100%乙醇Ⅰ、100%乙醇Ⅱ、二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ按顺序各一分钟。

8、封片观察：中性树胶封片，镜下观察。

五、注意事项

1.包埋/切片后烤片温度过高，均会使蛋白质发生质变，可能发生拒染，造成切片染色模糊不清。

脱蜡必须干净，脱蜡不净会导致切片着色不均、点状或片状不着色，核浆对比不清。取出后，若不及时放于二甲苯中，蜡质会即刻凝固。

2.    分化时间是关键，显微镜观察分化程度，质核区分明显为佳（核深质浅<质基本无色>，整体偏蓝）。如果过分延长分化时间将导致染色太浅，应重新染色后再进行分化。

3.    透明不彻底：切片如在二甲苯中有白雾现象发生即表示乙醇脱水未尽，应将切片退回无水乙醇，更换乙醇、二甲苯，以求彻底脱水与透明，否则镜下组织结构模糊不清。

4.封片前可用少量二甲苯稀释中性树胶，减少封片时产生的气泡。将稀释后的树胶使用大号棉签滴加至组织区域。封片时，纵向垂直按压盖玻片，至树胶覆盖组织区域即可。保持下压力10s，防止树胶回缩。期间，勿揉搓玻片，致组织碎裂。