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细菌多相分类鉴定实验-醌组分分析

郭丹媛, 王宏川刘兰 |  2023-12-08  | DOI: 10.21769/BioProtoc.v1357
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视频简介醌组分分析是潜在细菌新物种多相分类鉴定实验中的化学分类实验中的一项重要指标。细菌的细胞质膜上主要包含甲基萘醌和泛醌两种类型的醌,由于一种细菌通常只具有一种醌型,因此对于细菌细胞质膜上醌的类型的确定对于细菌具有了分类学意义。本视频介绍了醌组分分析的完整实验操作步骤,能够与其它化学分类实验结果相结合,为细菌新物种分类地位的确定提供重要参考。
  • 视频介绍

一、视频摘要

醌组分分析是潜在细菌新物种多相分类鉴定实验中的化学分类实验中的一项重要指标。细菌的细胞质膜上主要包含甲基萘醌和泛醌两种类型的醌,由于一种细菌通常只具有一种醌型,因此对于细菌细胞质膜上醌的类型的确定对于细菌具有了分类学意义。本视频介绍了醌组分分析的完整实验操作步骤,能够与其它化学分类实验结果相结合,为细菌新物种分类地位的确定提供重要参考。

 

二、关键词

细菌,新物种,多相分类,甲基萘醌,泛醌

 

三、实验样品信息,试剂、耗材或仪器

1. 样品信息

潜在细菌新物种及参比菌株的冻干菌体,各100mg

 

2. 试剂和耗材

每单株菌:250mL锥形瓶一个,称量纸若干,玻璃珠若干,铝箔纸,氯仿:甲醇(V/V=21)溶液40mL100mL旋蒸瓶一个,瓶托一个,漏斗一个,滤纸若干,100μL移液枪一只,枪头若干,丙酮0.5-1.0mL1.5mL离心管若干,GF254硅胶板一个,2μL移液枪一只,展层缸,毛面玻璃板,甲苯适量,254hm紫外灯,甲醇0.5mL,棕色进样瓶,内衬管,注射器,0.22μm过滤器。

 

3. 仪器和软件

摇床一台,旋转蒸发仪一台,高效液相色谱。

 

四、实验操作

1. 菌体的培养与收获

1.1菌株的培养:待测菌株可以液体培养也可固体培养,培养一定时间且确认无污染后则可进行菌体的收集;

1.2菌体的收集与干燥:液体通过离心收集菌体,固体可直接刮取,用蒸馏水洗涤两次,离心后-80℃3天,真空抽3天,冻干菌体4℃保存备用或放入干燥器干燥保藏。

2. 醌的提取与纯化

2.1 取冻干菌体约100mg,加入氯仿:甲醇=21的溶液40mL,在黑暗处磁力搅拌10h左右或摇瓶过夜;

2.2 在黑暗处用滤纸过滤并收集滤液;

2.3 用减压旋转薄膜蒸发仪40℃避光减压蒸馏至干燥;

2.4 GF254硅胶板沿上下边缘各1cm距离处画好基线,并提前在65℃条件下活化约半小时;用0.5-1.0mL的丙酮重溶干燥物,长条状点样于GF254硅胶板上;

2.5 用甲苯做展层剂展层约20min;

2.6 展层结束后取出风干,随后用254hm紫外灯照射观察。Rf=0.8,在绿色荧光背景下呈暗褐色的带即为甲基萘醌的位置,VK位点齐平,若Rf=0.4~0.5的位置有暗褐色的带则为泛醌组分。使用铅笔沿条带轮廓勾画好;

2.7 刮下Rf=0.8的条带,用0.5mL甲醇溶解,然后用过滤器(d=0.22µm)过滤除去硅胶,收集滤液,即得甲基萘醌的甲醇溶液(泛醌则刮取Rf=0.4~0.5的条带)。置于4黑暗处保存。

3. 高效液相色谱(HPLC)测定醌的组分

HPLC参数设置

仪器名称

Agilent 1100

色谱柱

Zorbax Eclipse XDB-C18 5µm,250×4.6mm id

流动相

甲醇:异丙醇=21V/V

进样量

20µL

检测波长

270hm

流速

1.00mL/min

柱温

40

 

4. 结果分析

根据标准条件下不同醌组分与洗脱时间的关系,结合参比菌株的校正,分析潜在细菌新物种的醌型。

 

五、注意事项

1. 对潜在的细菌新分类菌株进行醌组分分析,必须以参比菌株作为对照,本视频仅展示了一株菌株的操作流程,实际操作时应以实际菌株数目平行进行上述实验操作;

2. 本视频由于拍摄的灯光等实际需要,实际操作时需注意醌极易氧化,在提取与保存的过程中,应避免强光,尤其是直射光,切勿与水、酸以及碱接触,提纯的醌应尽快测定分析,注意绝对不可遇水!涉及到有机易挥发试剂的操作应在通风橱中进行;

3. 摇瓶过夜时需确保锥形瓶固定紧密;

4. 使用丙酮重溶干燥物时,要反复多次吸打混匀使瓶壁上的干燥物溶解充分;

5. GF354硅胶板最好事先在65℃条件下活化约半小时;

6. GF254硅胶板上点样时,应注意不要点到硅胶板的两个边缘,点样结束后可适当晾干;

7. 如出现多个条带且无法判断,可采取全部刮下的策略,编号序号,提取结束后依次上样,直至得到结果为止;

8. 展层结束,要等风干后才可使用紫外灯照射观察,否则无法观察到条带;

9. 使用注射器过滤并转移醌的甲醇滤液时,预留空气可全部挤出液体。

 

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