APCmin+/-小鼠的基因型鉴定

一、视频摘要

APC^min/+小鼠作为自发结直肠癌模型的常用工具，常常需要与目的基因缺失小鼠进行交配繁殖，得到相应目的基因的APC^min/+小鼠，因此在配种过程中，APC^min/+小鼠的鉴定是必不可少的步骤。本视频通过前期提取的F1代小鼠的脚趾基因组DNA进行PCR扩增、跑胶及成像，为后续筛选阳性F1代进而获得F2代提供基础。

二、关键词

APC^min/+、基因型鉴定、结直肠癌

三、实验样品信息，试剂、耗材或仪器

1. 样品信息

1-2周龄小鼠脚趾。

2. 试剂和耗材

试剂：

1.       组织消化液；

2.       蛋白酶K；

3.       5 M Nacl；

4.       氯仿；

5.       异丙醇；

6.       75%乙醇；

7.       2 x EasyTaq酶；

8.       去离子水；

9.       2%琼脂糖胶；

10.      DL2000 DNA ladder。

耗材：

1.       1.5 ml EP管;

2.       100 μl EP管。

3. 仪器和软件

1.       水平电泳仪；

2.       凝胶成像系统；

3.       水平摇床；

4.       离心机。

四、实验操作

1. 组织消化：将小鼠组织置于1.5 ml的EP管中，加入400 μl组织消化液及15 μl蛋白酶K，56℃消化过夜。

2. DNA提取： 在过夜消化的组织液中加入5 M的Nacl，震荡，再加入550 μl的氯仿后震荡，静置10分钟，11000 g室温离心10分钟。取500 μl到新的EP管中，加入等体积的异丙醇后上下颠倒，11000 g室温离心10分钟。弃上清，加入800 μl的75%乙醇，上下颠倒使白色沉淀悬浮，置于摇床清洗1小时后室温离心5分钟，再次用75%乙醇清洗后7500 g离心5分钟，弃上清室温晾干，加入100 μl去离子水溶解DNA。

3. PCR体系配置：2 x EasyTaq酶： 25 μl； 引物mix: 10 μl； DNA模板: 5μl； ddH₂O: 10 μl。

反应程序：95℃ 5 min                      95℃ 30 s; 60℃ 20 s; 72℃ 20 s                   72℃ 10 min; 4℃∞

40 cycle

4. 取产物进行电泳，随后进行成像。

五、注意事项

1. 裂解鼠尾一定要充分。因为如果裂解过程中组织与裂解液始终保持静止，而没有翻转的过程，这会导致 DNA 和鼠毛之类的杂质没有完全分开。离心去除杂质的过程中，DNA 就会随着这些杂质一起被抛弃了。

2. DNA 模板不是越多越好的。一般建议将模板浓度控制在 50-100ng/µl  进行 PCR 扩增。