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APCmin+/-小鼠的基因型鉴定

远俊虎, 张帆宇, 马岭王坦 |  2023-12-08  | DOI: 10.21769/BioProtoc.v1392
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视频简介APCmin+/-小鼠作为自发结直肠癌模型的常用工具,常常需要与目的基因缺失小鼠进行交配繁殖,得到相应目的基因的APCmin+/-小鼠,因此在配种过程中,APCmin+/-小鼠的鉴定是必不可少的步骤。本视频通过前期提取的F1代小鼠的脚趾基因组DNA进行PCR扩增、跑胶及成像,为后续筛选阳性F1代进而获得F2代提供基础。
  • 视频介绍

一、视频摘要

APCmin/+小鼠作为自发结直肠癌模型的常用工具,常常需要与目的基因缺失小鼠进行交配繁殖,得到相应目的基因的APCmin/+小鼠,因此在配种过程中,APCmin/+小鼠的鉴定是必不可少的步骤。本视频通过前期提取的F1代小鼠的脚趾基因组DNA进行PCR扩增、跑胶及成像,为后续筛选阳性F1代进而获得F2代提供基础。

 

 

二、关键词

APCmin/+、基因型鉴定、结直肠癌

 

三、实验样品信息,试剂、耗材或仪器

1. 样品信息

1-2周龄小鼠脚趾。

 

2. 试剂和耗材

试剂:

1.       组织消化液;

2.       蛋白酶K

3.       5 M Nacl

4.       氯仿;

5.       异丙醇;

6.       75%乙醇;

7.       2 x EasyTaq酶;

8.       去离子水;

9.       2%琼脂糖胶;

10.      DL2000 DNA ladder

耗材:

1.       1.5 ml EP;

2.       100 μl EP管。

 

3. 仪器和软件

1.       水平电泳仪;

2.       凝胶成像系统;

3.       水平摇床;

4.       离心机。

 

 

 

四、实验操作

1. 组织消化:将小鼠组织置于1.5 mlEP管中,加入400 μl组织消化液及15 μl蛋白酶K56℃消化过夜。

2. DNA提取: 在过夜消化的组织液中加入5 MNacl,震荡,再加入550 μl的氯仿后震荡,静置10分钟,11000 g室温离心10分钟。取500 μl到新的EP管中,加入等体积的异丙醇后上下颠倒,11000 g室温离心10分钟。弃上清,加入800 μl75%乙醇,上下颠倒使白色沉淀悬浮,置于摇床清洗1小时后室温离心5分钟,再次用75%乙醇清洗后7500 g离心5分钟,弃上清室温晾干,加入100 μl去离子水溶解DNA

3. PCR体系配置:2 x EasyTaq酶: 25 μl; 引物mix: 10 μl DNA模板: 5μl ddH2O: 10 μl

反应程序:95 5 min                      95 30 s; 60 20 s; 72 20 s                   72 10 min; 4℃∞

40 cycle

4. 取产物进行电泳,随后进行成像。

五、注意事项

1. 裂解鼠尾一定要充分。因为如果裂解过程中组织与裂解液始终保持静止,而没有翻转的过程,这会导致 DNA 和鼠毛之类的杂质没有完全分开。离心去除杂质的过程中,DNA 就会随着这些杂质一起被抛弃了。

2. DNA 模板不是越多越好的。一般建议将模板浓度控制在 50-100ng/µl  进行 PCR 扩增。

 

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