细胞蛋白提取、Bradford法蛋白定量以及蛋白印迹实验

一、视频摘要

原理及目的：Western Blot是一种常用的分子生物学实验技术，用于检测蛋白质在细胞或组织中的表达情况，其基本原理包括以下几步：

1. 样品制备：首先，从细胞或组织中提取蛋白质，并进行适当的处理以去除杂质和干扰物质。
2. 凝胶电泳：将提取的蛋白质样品进行聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE），根据蛋白质分子量的大小进行分离。
3. 转膜：将经过电泳分离的蛋白质从凝胶转移到固相支持物（如硝酸纤维素膜或PVDF膜）上。这个过程可以通过电场作用或特殊虹吸装置实现。
4. 封闭：用非特异性蛋白溶液封闭固相支持物上的空白位点，以减少非特异性结合。
5. 抗体孵育：将特异性抗体与固相支持物上的蛋白质进行孵育，使抗体与目的蛋白特异性结合。
6. 二抗孵育：加入与一抗结合的酶或同位素标记的二抗，形成抗体-抗原-二抗复合物。
7. 显色或放射自显影：通过底物显色或放射自显影技术，检测特异性目的基因表达的蛋白成分。

实验的结果：通常表现为一系列条带，这些条带是在固相支持物（如硝酸纤维素膜或PVDF膜）上通过特定的抗体检测到的蛋白质。这些条带的位置和强度可以提供关于蛋白质的重要信息。

条带位置：条带的位置通常反映了蛋白质的分子量。由于WB实验中的凝胶电泳步骤是根据蛋白质分子量大小进行分离的，因此分子量不同的蛋白质会在凝胶的不同位置形成条带。通过与已知分子量的标准品比较，可以确定样品中蛋白质的分子量。

条带强度：条带的强度通常反映了蛋白质的表达水平。在WB实验中，蛋白质的表达水平可以通过比较不同样品中相同蛋白质的条带强度来评估。条带强度可以通过不同的方法进行量化，如使用密度扫描仪或图像分析软件。

二、关键词

蛋白提取；蛋白定量；蛋白印迹

三、实验样品信息，试剂、耗材或仪器

1. 样品信息

2. 试剂和耗材

提前培养好的细胞、加样枪、枪头、PBS、冰盒、RIPA Buffer、细胞刮刀枪头盒、1.5ml的EP管、Quick Start Bradford 1✖️ Dye Reagent、96孔板、1.5EP管、滤纸、抢头、加样抢、试管架子、提前配好的BSA、金属浴、抢头、加样抢、5✖️Loading Buffer、1.5EP管、高压ddH2O

上层胶、下层胶、短玻璃板、长玻璃板、梳子、玻璃板夹、APS、抢头、加样枪、玻璃板架、容器、电泳槽、10✖️Tris/Glycline/SDS 、提前配好的胶、marker、量桶、上样抢头、上样枪、变性好的蛋白、DW水。

3. 仪器和软件

电泳仪、转膜仪、曝光仪等

四、实验操作

1. 样品制备：首先，从细胞或组织中提取蛋白质，并进行适当的处理以去除杂质和干扰物质。
2. 凝胶电泳：将提取的蛋白质样品进行聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE），根据蛋白质分子量的大小进行分离。
3. 转膜：将经过电泳分离的蛋白质从凝胶转移到固相支持物（如硝酸纤维素膜或PVDF膜）上。这个过程可以通过电场作用或特殊虹吸装置实现。
4. 封闭：用非特异性蛋白溶液封闭固相支持物上的空白位点，以减少非特异性结合。
5. 抗体孵育：将特异性抗体与固相支持物上的蛋白质进行孵育，使抗体与目的蛋白特异性结合。
6. 二抗孵育：加入与一抗结合的酶或同位素标记的二抗，形成抗体-抗原-二抗复合物。
7. 显色或放射自显影：通过底物显色或放射自显影技术，检测特异性目的基因表达的蛋白成分。

五、注意事项

8. 样品制备：样品制备是WB实验的关键步骤之一。确保样品中的蛋白质完整、无污染且浓度适宜。避免过度加热或反复冻融，以免破坏蛋白质的结构。
9. 凝胶电泳：凝胶电泳时，应选择合适的凝胶浓度和电泳条件，以确保蛋白质的有效分离。同时，注意避免样品溢出或漏入相邻孔中，以免干扰实验结果。
10. 转膜：转膜过程中，应确保凝胶与膜之间的紧密接触，避免气泡产生。选择合适的转膜条件和时间，以确保蛋白质完全转移到膜上。
11. 抗体选择和使用：选择特异性强的抗体，并按照推荐的稀释度、作用时间和温度进行抗体孵育。避免使用过期或变质的抗体，以免影响实验结果。
12. 显色和定影：在显色和定影过程中，注意控制时间，避免过度或不足。同时，确保使用的显色液和定影液新鲜、无污染。
13. 条带分析：在分析条带时，注意区分特异性条带和非特异性条带。对于模糊不清或异常的条带，需要进行重复实验或进一步的验证。
14. 实验记录和质量控制：详细记录实验过程中的所有操作步骤和条件，以便后续分析和质量控制。同时，设置适当的阴性和阳性对照，以确保实验结果的可靠性。