一、视频摘要
斑马鱼胚胎原位杂交实验，其核心在于整胚原位杂交技术，是基于碱基互补配对的原理，在胚胎组织或细胞结构保持不变的条件下，利用可检测的特异性标志物标记的RNA核苷酸片段与待测组织中目标RNA分子杂交，所形成的特异杂交双链经酶联抗体-抗原反应和酶催化显色反应后，在光学显微镜或电子显微镜下观察目标RNA分子的分布及丰度。这项技术在斑马鱼或其他物种中可以显示特定基因在转录水平上的时空表达模式，是发育遗传学研究的一项重要技术。
二、关键词
斑马鱼、整胚原位杂交技术、碱基互补配对
三、实验样品信息、试剂、仪器
1.样品信息
胚胎：多个不同时期的斑马鱼胚胎
2.试剂和耗材
渔用麻醉剂、2%KOH、3%H2O2、4%多聚甲醛固定液、甘油、双凹载玻片，
PBS、PBST、乙醇、阻断溶液、HYB、SSC、AP 缓冲液、碱性磷酸酶偶联Anti-Dig 抗体、NBT/BCIP
（24孔细胞培养板、90mm培养皿、1.5ml离心管）
3.仪器和软件
体视解剖显微镜、5号精细镊子、杂交炉
四、实验操作
1、实验预处理
1.1构建和制备探针：确定目的基因的cDNA序列，并通过PCR在反义链5’端引入T7启动子/3’端引入限制性酶切位点构建探针质粒。质粒经酶切回收制备线性化模板，并通过体外转录合成地高辛标记的反义RNA探针，纯化回收后定量。
1.2收集并固定胚胎：收集特定时期的胚胎，4%多聚甲醛低温过夜固定后对其进行脱色处理（超过24hpf的斑马鱼胚胎需要进行脱色处理，将3% H2O2和2% KOH以1：1的比例预混后的脱色液加入至胚胎中脱色，体视镜下观察色素消失后及时加入少许EtOH使胚胎沉淀并PBST清洗终止反应。梯度脱水后的胚胎可在-20℃条件下保存。
2、梯度复水
2.1梯度复水：从-20℃取出脱水处理过的胚胎，恢复至室温后，用75%乙醇
PBST溶液—50%乙醇PBST溶液—25%乙醇PBST溶液。1 ml/次；5 min/次进行梯度复水。
2.2漂洗：PBST漂洗三次。1ml/次；5 min/次进行漂洗。
3、胚胎消化处理
3.1蛋白酶消化处理：使用10 μg/ml蛋白酶K（proteinase K）对胚胎进行常温消化处理（蛋白酶K储液浓度为10 mg/ml，储存于-20℃，使用时用PBST稀释1000倍），处理的时间与胚胎的质量和发育时期相关。
3.2固定：用PBST溶液终止蛋白酶K消化反应并漂洗胚胎，然后加入4% 多聚甲醛室温下固定胚胎20 min，灭活蛋白酶。接着继续用PBST漂洗4次，5 min/次。
4、预杂交和杂交
4.1预杂交：在每一管胚胎中加入400μl HYB润洗胚胎，垂直放置离心管，待胚胎沉到管底后即可移去HYB；再加500μl新的HYB置于65℃的杂交炉中预杂交2-5 h，移去离心管中预杂交的HYB。
4.2杂交：将400μl提前预热至65℃的含2~3ng/ul的RNA探针的HYB溶液（使用前需要在金属浴72℃中温育5min，破坏RNA的二级结构，然后迅速置于冰上）加入预杂交后的胚胎中，在65℃杂交炉中静置过夜。
5、清洗回收探针
5.1探针回收：回收探针溶液并重新保存于-80℃，可反复使用3~5次。
5.2胚胎漂洗：漂洗步骤仍需要在65℃杂交炉内进行，高温有利于降低背景着色：HYB漂洗1次，15 min；使用75% HYB+25% 2×SSC溶液洗涤1 次，15 min；使用50% HYB+50% 2×SSC溶液洗涤1 次，15 min；使用25% HYB+75% 2×SSC溶液洗涤1 次，15 min；使用2×SSC溶液洗涤1 次，15 min；使用0.2×SSC溶液洗涤2 次，每次30 min；
接下来为室温操作：
使用75% 0.2×SSC+25% PBST溶液洗涤1 次，10 min；使用50% 0.2×SSC+50% PBST溶液洗涤1 次，10 min；使用25% 0.2×SSC+75% PBST溶液洗涤1 次，10 min；使用PBST漂洗1次，10 min。
6、阻断以及抗体孵化
6.1阻断：加入500μl阻断溶液，在室温慢速摇动下，阻断3 h。
6.2抗体孵育：加入600μl以1:3000比例稀释于阻断溶液的抗地高辛抗体，4℃慢速摇动过夜。
7、抗体回收以及显色
7.1清洗回收抗体：移去抗体溶液回收至-20℃，用PBST 漂洗6次，15 min/次。最后一次漂洗后，提前将24孔板用AP缓冲液润洗，并标记清楚各个胚胎时期后，将胚胎转移到24孔培养板中。
7.2显色：加入500 μl碱性磷酸酶显色缓冲液（AP buffer）润洗胚胎 2 次，5 min/次；冰上配置染色液：每1ml的AP缓冲液加入4.5μl的NBT和3.5μl的BCIP；然后加入显色液，避光反应2~3h。
8、清洗
8.1终止显色：当目标染色出现后，使用PBST漂洗两次，5 min/次，以停止反应。
8.2脱水保存：梯度脱水至EtOH可保存至-20℃。
9、脱水至甘油并拍照
9.1梯度复水：梯度复水至PBST，含30%、50%、70%甘油的PBS脱水至甘油中。
9.2拍照：放在显微镜下拍照。
五、注意事项
(1) RNA 在常温下极易降解，涉及 RNA 的操作，在探针去除之前，以及探针的合成与纯化过程，必须严格防止RNase的污染。操作需要要戴乳胶手套并始终佩戴口罩进行，使用 RNA专用枪头、离心管、电泳槽等，尽量缩短 RNA 在常温或 37℃放置时间，电泳使用高压短时间（180v，10~15 min）的程序。
(2) 注意所加溶液与胚胎温度的差异，应当先预热再使用。一般探针溶液加入量为 200～400μl，洗涤溶液加入量为 1ml，管平放以使胚胎分散与溶液充分接触，但加入探针一步由于溶液过少而竖直放置。
(3) 吸取胚胎的枪头应剪去尖端以扩大开口。吸时动作要轻。任何时候都要防止丢失胚胎，可在换前一管溶液时将后一管竖直放置让胚胎沉降一会以免吸走。
(4）加入溶液时，尽量让溶液贴着管壁流下，减少对胚胎的冲击，避免破坏损伤胚胎。
(5) 如同时对多管进行吸去溶液和加入溶液工作，应当按照同样的顺序依次操作，以保证其处理时间基本一致。避免漏加溶液。
(6) 注意保护离心管上的标记。
六、结果分析
实验结果呈现不同时期的斑马鱼胚胎原位杂交情况。
图1. 全胚原位杂交显示rpl17的时空表达模式
图2. 全胚原位杂交显示myoD的时空表达模式
七、参考文献
[1] Cheng C, Mengjia L, Shuo L, et al. The nuclear gene rpl18 regulates erythroid maturation via JAK2-STAT3 signaling in zebrafish model of Diamond-Blackfan anemia[J]. Cell death disease, 2020, 11(2): 135.
[2] Thisse C, Thisse B. High-resolution in situ hybridization to whole-mount zebrafish embryos[J]. Nature protocols, 2008, 3(1): 59-69.
[3] Westerfield M. The Zebrafish Book. A Guide for the Laboratory Use of zebrafish (Danio rerio). 4th Edition[M]. Eugene: University of Oregon Press, 2000.
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