一、视频摘要
海绵共附生菌种是海洋微生物的重要组成部分，是海洋天然产物的重要来源，其次级代谢产物因结构新颖，且具有较强的活性，已经成为新药先导化合物发现的重要来源。本实验重点对海绵共附生菌种分离与培养的操作进行细致阐述，着重介绍了海绵样品的预处理及后续菌种单菌落划线纯化的过程，旨在提供较为完善的分离与培养的技术方法，为后续分析菌株多样性，发现强活性菌株，分离新颖的次级代谢产物奠定基础。
二、关键词
海绵共附生，分离培养，单菌落，平板划线法
三、实验样品信息，试剂、耗材或仪器
1. 样品信息
海绵，由海军特色医学中心从东海海域采集，海军军医大学基础医学院生物化学与分子生物学教研室保藏。
2. 试剂和耗材
2.1试剂
75%酒精、氯化钠、氯化镁、硫酸镁、氯化钙、碳酸氢钠、氯化钾、溴化钠、硼酸、硅酸钠、磷酸、六氯化二铝、氨、硝酸锂、蒸馏水、酵母粉、麦芽提取物、葡萄糖、琼脂粉、蛋白胨、放线菌酮、制霉菌素、新生霉素、萘啶酮酸
2.2耗材
一次性培养皿（无菌）、涂布棒、手术剪、镊子、15ml离心管、枪头、一次性接种环（无菌）、200μL枪头、1000μL枪头、75%酒精。
3. 仪器和软件
高压蒸汽灭菌锅（上海申安）；
生物安全柜（ESCO）；
超净台（淀山湖）；
恒温震荡摇床（知楚）；
恒温培养箱（Bluepard）。
四、实验操作
（一）实验器材准备及培养基的配置
1.将所有所需耗材用报纸包好高压蒸汽灭菌（115℃，30min）。
2.按配方配置人工海水、ISP2培养基（液体+固体）和YMPG培养基（液体+固体），灭菌（115℃，30min）。
3.将抗生素配成溶液后，用0.22μm滤膜过滤除菌。
（放线菌酮—乙醇、制霉菌素—DMSO、新生霉素—钠盐水溶液、萘啶酮酸—稀NaOH）
4.待培养基灭菌后降温至50-60℃时加入灭菌抗生素溶液，摇匀，得到ISP2k培养基和YMPGk培养基（k为加抗生素）。
5.分别倒入一次性无菌平皿中，得到ISP2、YMPG、ISP2k、YMPGk平板，备用。
（二）海绵样本的处理与培养
1.使用75%酒精对海绵表面进行消毒。
2.分别取两块1cm3小块，用无菌人工海水清洗。
3.剪碎，分别加至100ml ISP2k和YMPGk液体培养基内，28℃ 180rpm，培养3天至浑浊。
4.分别吸取1ml培养液至9ml无菌人工海水中（稀释10倍），而后吸150μL至对应ISP2k、YMPGk平板表面，用一次性无菌涂棒涂抹均匀，封口，28℃静置培养至长出单菌落。
5.挑取单菌落至对应ISP2、YMPG平板上，进行划线操作，划好线后做好标记，封口，28℃静置培养。
6.重复上述操作至平板上为单一菌种。
（三）菌种测序及鉴定
1. 将单菌落平板邮寄至生工公司，利用16SrDNA 及ITS序列测序的方法进行种属鉴定。
五、注意事项
1.配制海水时，溶解海盐的容器不要用金属容器(铝铁等)，防止对容器造成腐蚀及引起反应改变海水离子成份。
2.全程无菌操作，避免外来菌对实验结果造成干扰。
3.单菌落培养时应每隔一段时间进行观察，避免生长过多影响单菌落挑取。
4.抗生素于培养基灭菌后降温至50-60℃时再加入，避免失效。
5.固体平板要确保无气泡，均匀且不能过多，且平板保存不宜超过1周。
六、结果分析（可选）
（一）从海绵样本中通过多次分离培养得到纯种
（二）利用16SrDNA及ITS技术获得菌种种属信息（截取部分实验信息）
1.S6331-1菌株16SrDNA序列 558bp
CTCCGTAGGTGAACCTGCGGAGGGATCATTACAGAGTTATCCAACTCCCAAACCCATGTGAACTTATCTCTTTGTTGCCTCGGCGCAAGCTACCCGGGACCCCGCGCCCCGGGCGGCCCGCCGGCGGACAAACCACAACTCTGTTATCTTAGTTGATTATCTGAGCGTCTTATTTAATAAGTCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCATTAGTATTCTAGTGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTCAACCCCTAAGCACAGCTTACTGTTGGGACTCTACGGCCCCCGTAGTTCCCCAAAGCCATTGGCGGAGTGGCAGTAGTCCTCTGAGCGTAGTAATTCTTTATCTCGCTTTTGTTAGGTGCTGCCCCCCCGGCCGTTAAACCCCCCAATTTTTTCTGGTTGACCTCGGATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAGCGGAGGAA
2.数据库比对信息
3.种属信息
检测结果：Nigrospora oryzae（稻黑孢霉）
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