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Western Blot

孙振东, 刘露露 和 黄云鹏 |  2023-12-08  | DOI: 10.21769/BioProtoc.v1437
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视频简介目的:检测目的蛋白表达量的有无以及多少
原理:利用聚丙烯酰胺凝胶电泳,分离出不同大小的条带。通过转膜将蛋白条带转移到PVDF/NC膜上,利用抗体特异性对目的条带进行杂交。每次的pbst洗涤均会去除非特异结合的抗体,而特异结合的抗体会通过其二抗偶联的辣根过氧化物酶(HRP)和底物反应,使用特定的曝光仪器进行反应信号的记录。
  • 视频介绍

一、视频摘要

Western blot(又称免疫印迹)是一种常用的蛋白质分析方法,用于检测特定蛋白质在样本中的存在和相对表达水平。它结合了凝胶电泳和免疫学技术。通过Western blot,可以确定特定蛋白质的存在与否,并且还可以提供关于蛋白质相对表达水平的信息。这种技术广泛应用于生物医学研究中,尤其在蛋白质组学和免疫学研究中起到重要的作用。

二、关键词

Western blot 免疫印迹 凝胶电泳 蛋白水平

 

三、实验样品信息,试剂、耗材或仪器

1. 试剂和耗材

试剂:

甘氨酸

SDS

Tris

甲醇

脱脂奶粉

PBS

吐温-20

一抗和二抗

显影液(A液和B液)

耗材:

PVDF

滤纸

2. 仪器和软件

电泳槽和电源

转膜设备

化学发光系统

ImageJ/Fiji

四、实验操作

1. 电泳。使用聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)将蛋白质按照大小分离。将胶板固定在胶架上以后,向电泳槽和胶板空隙中,倒入电泳液。向样品孔内依次加入待跑的蛋白样品,将点完样的胶板,平移至电泳槽内,盖上电泳槽盖子,保证电极颜色一致,恒压100伏电泳1小时左右。

2. 快转。量取含有全部marker的胶板大小,并裁取相同大小的PVDF膜。使用撬板撬出胶块,切掉浓缩胶和空白分离胶的部分,将胶块浸泡在单蒸水中。向塑封袋中,倒入适量甲醇,将裁好的PVDF膜,在甲醇中浸泡数秒后活化,同样将PVDF膜平衡液,倒入塑封袋中,把活化好的PVDF膜,转移到平衡液中,赶压出多余气泡后,平衡1分钟左右。向转膜液桶中,倒入快转液,并拧紧盖子。取出快转仪中的转膜夹,从正极开始平铺转膜所需要的材料。从下到上顺序依次为,转膜垫片,PVDF膜,胶块,转膜垫片。夹好转膜夹将其插入对应的转膜电极槽中,启动对应转膜槽,十分钟左右后,转膜结束,取出转膜夹,去掉上面覆盖的垫片,将PVDF膜和胶块,一起浸泡在单蒸水中,使其自然分离。

3. 慢转。同样,量取胶块大小,并裁出对应的PVDF膜,和两份同样大小的三层滤纸。用单蒸水清洗玻璃棒,转膜槽以及转膜夹。将配好的转膜液,倒入到转膜槽内。单蒸水浸泡切好的胶块。甲醇活化PVDF膜,取出转膜夹,慢转是从负极开始平铺,从下到上的顺序依次为,三层滤纸,胶块,PVDF膜,三层滤纸。首先将滤纸在转膜液中浸泡后,平铺在负极海绵垫中间,以电泳点样时相反的方式铺平胶块,并使用玻璃棒赶出多余气泡,把活化好的PVDF膜在转膜液中浸泡后,倒扣在胶块上,以保证蛋白样品转到膜的正面,平铺浸泡过的三层滤纸。放上海棉垫,夹紧转膜夹,将其插入转膜电极内,在槽子内放入一块冰袋,并将转膜槽放置在冰浴环境下,防止其转膜时产生的温度过高,恒压100伏,转膜90分钟,电流一般维持在200300伏。将转好的膜浸泡在PBST中,清洗数秒后,弃掉PBST

4. 封闭。倒入5%的脱脂牛奶(PBST稀释),室温封闭30分钟。回收封闭牛奶,倒入PBST洗涤3次,每次数秒到数分钟不等。

5. 一抗孵育。裁取比膜大一些的塑封袋,将PVDF膜放入其中,根据目的条带大小,沿两侧marker裁取所需的PVDF膜,裁取比膜稍微大一些的塑封袋将裁好的膜放入塑封袋中,使用热风机封闭一侧,向每个膜中,加入约1ml1:2000稀释好的一抗,使用热封机封口,回收多余抗体,剪掉抗体袋的多余部分,将其粘到纸胶带并固定到翻转混匀仪上,室温孵育2小时或4℃过夜。孵育完成后,取下抗体袋,取出PVDF膜并回收一抗,在剪开和夹取不同抗体时,建议擦拭剪刀并在PBST中洗涤镊子头部,防止不同抗体污染。取出的PVDF膜,使用PBST洗涤3次,每次10分钟。6. 二抗孵育。除内参外,其余蛋白所需的二抗均用5%的脱脂牛奶稀释,稀释比例为1:2000。内参使用PBST稀释,稀释比例不变。同样裁取比PVDF膜大一些的塑封袋,使用热封机进行抗体孵育。室温孵育12小时后,拆出PVDF膜,二抗不需要回收。将膜放在PBST中洗涤三次,每次10分钟。

7. 显影。依据每张膜100微升的显影液,共准备700微升。显影液分为a液和b液,所以每种吸取350微升即可。将混好的显影液用吸水纸覆盖以达到避光效果。将膜平铺在PE手套上以后,均匀滴加显影液,并孵育数秒。孵育好的PVDF膜转移到显影仪中,设定具体的时间和灵敏度,进行显影曝光。显影结果将分为目的条带,marker以及二者的合并图片。将图片保存导出后,整理结果并进行image j的定量分析。

 

 

五、注意事项

1. 蛋白质加载量:要注意在SDS-PAGE电泳中加载适当的蛋白质量。过高的负载量可能导致样品堆积和模糊的带状图案,而过低的负载量可能导致蛋白质信号太弱。

2. 转膜条件:转膜时,要根据目标蛋白质的大小和性质来选择合适的转膜条件。

3. 封闭:在进行Western blot分析之前,应该对转膜膜进行封闭,以防止非特异性结合和背景信号。

4. 二抗选择:要确保与一抗来源物种不同。

5. 重复实验:为了验证结果的可靠性,应该进行重复实验。重复实验可以提供更可靠的数据,并帮助排除实验误差和偶然因素的影响。

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